Biochemická diagnostika ochorení pečene. Stručná informácia o štruktúre pečene.

Pečeň je nepárový orgán s hmotnosťou 1300 - 1800 g. Viac ako 60% pečeňových buniek sú parenchymálne bunky - hepatocyty, 25% sú bunky retikulohistiocytického systému (CSG), endotelové alebo Kupfferove bunky, zvyšok tvoria duktálne, spojivové tkanivo a ďalšie bunky.

Štruktúrna a funkčná jednotka pečene je pečeňový acinus alebo pečeňový lobulus, ktorý je tvorený primárne z hepatocytov (Obr. 1). V strede pečeňového laloku je hepatálna žila, z ktorej vyžarujú pečeňové lúče, pozostávajúce hlavne z jedného radu hepatocytov. Pečeňová žila sa nachádza v strede lolule a na okraji je portálové pole s vetvami pečeňovej tepny, portálnej žily a najmenšou kapilárou žlče. Medzi lúčmi sú dilatované kapiláry - dutiny pečene. Hepatocyty tvoriace lúče, na jednej strane nazývané vaskulárny pól, smerujú k sinusom, a invaginácie membrány susednej strany, nazývanej biliárny (biliárny) pól, tvoria primárne žlčové kapiláry (obrázok 2). Charakteristickým znakom žlčových kanálikov je ich úplná izolácia od krvných kapilár. Cez membránu endocytozy vaskulárnych pólov a exocytózy rôznych molekúl a žlčových ciest uvoľňovanie látok z bunky. Portálna žila a pečeňová tepna vstupujú do pečene a pečeňová žila a žlčový kanál vychádzajú.

Acini je rozdelený do 3 funkčných zón: v 1 zóne sú bunky susediace s portálovým traktom, sú lepšie vybavené kyslíkom a živinami. Bunky tretej zóny, umiestnené okolo pečeňovej žily, sú menej zásobované kyslíkom a substrátmi a citlivejšie na ischémiu. Sú to bunky tejto zóny, ktoré sa podieľajú na metabolizme liekov a sú cieľom pre hepatotoxické lieky.

Pri vykonávaní laboratórnych štúdií pre správnu diagnózu je dôležité poznať distribúciu enzýmov vo vnútri bunky. Ďalej sú uvedené údaje o enzýmoch najčastejšie používaných na diagnostiku.

cytoplazma obsahuje alanínaminotransferázu (ALT), súčasť aspartátaminotransferázy (AST), laktátdehydrogenázy (LDH), súčasť gamaglutamyltranspeptidázy (GGT) a ďalších enzýmov.

V mitochondriách (MX) väčšina AST (približne 70%), glutamátdehydrogenázy (GLDG), alkoholdehydrogenázy a mnohých ďalších sa koncentruje.

Hrubé endoplazmatické retikulum obsahuje cholínesterázu (CE), atď.

V hladkom endoplazmatickom retikule sú glukóza-6-fosfatáza, UDP-glukuronyltransferáza, hem-obsahujúci membránovo viazaný cytochróm P-450 a ďalšie.

lysozomy obsahujú kyslé hydrolázy (kyslá fosfatáza, ribonukleáza atď.), ktoré sú aktivované znížením pH bunky.

Biliárne pólové mikrovlky obsahujú membránovo závislé enzýmy, ako je alkalická fosfatáza (alkalická fosfatáza), 5-nukleotidáza, časť GGT, leucín aminopeptidáza (LAP).

Znalosť architektúry pečene a distribúcia enzýmov v bunke objasňuje nerovnomerné zvýšenie aktivity enzýmov v rôznych patologických procesoch. S prevládajúcou léziou centrálnych častí lalokov (akútna alkoholická hepatitída, akútna venózna stáza, atď.) Sa zvyšuje aktivita mitochondriálnej glutamátdehydrogenázy - nedostatok kyslíka a poškodenia MX a porážka portálnych ciest (akútna vírusová hepatitída, chronická aktívna hepatitída - CAG) sa zvyšuje aktivita cytoplazmatickej transaminázy.

Biochemická diagnostika chorôb

Kontaktné informácie
Tovary a služby
opravy

Klinická biochémia je spolu s patologickou a normálnou fyziológiou jedným z troch veľrýb základnej lekárskej vedy. Bez znalosti základov tejto disciplíny sa lekár nelíši od školáka, ktorý má predstavu o chorobách len na základe symptómov a znakov.

Medzitým klinické a biochemické ukazovatele, ktoré monitorujú zmeny v bunkách na úrovni molekúl a chemických reakcií, umožňujú spoľahlivo určiť príčiny patologických stavov tela ako celku. Závisí to od úrovne školenia klinika, ako kompetentne pristupuje k výberu potrebných biochemických analýz pre komplexné vyšetrenie pacienta a bude tiež schopný vyhodnotiť ich diagnostické informácie, hodnotu a spoľahlivosť.

V medicíne sa široko používajú laboratórne biochemické štúdie na:

- presné stanovenie diagnózy,

- zistenie ochorenia v predklinickom štádiu,

- posúdiť účinnosť predpísanej liečby, t

- monitorovanie stavu pacienta

- predpovedanie možných komplikácií a výsledkov ochorenia.

Odporúčané biochemické testy

Boli vyvinuté štandardizované výskumné metódy pre hlavné systémy tela, ktoré sa musia vykonávať bez zlyhania s príslušným komplexom symptómov:

Patológia kardiovaskulárneho systému.

Angina pectoris (koagulogram, cholesterol s frakciami, aminotransferázy, triglyceridy, lipoproteínové frakcie, aterogénny index, laktát dehydrogenáza s izoenzýmami, kreatínkináza s izoenzýmami);

Hypertenzia (cholesterol s frakciami, cholínesteráza, močovina, kyselina močová, kreatinín, triglyceridy, aterogénny index, hladina elektrolytov K a Na);

Ateroskleróza (cholesterol s frakciami, lipoproteínové frakcie, triglyceridy, aterogénny index);

Infarkt myokardu (stresové proteíny, kreatínkináza s izoenzýmami, aminotransferázy, močovina, cholínesteráza, koagulogram, kyselina močová, laktátdehydrogenáza s izoenzýmami);

Hypotenzia (17ОКС, obsah hydrokortizónu v moči).

Patológia systému spojivového tkaniva.

Reumatizmus (celkový proteín s proteínovými frakciami, glykoproteínmi, testami sedimentov, stresovými proteínmi, hexózami glykoproteínov, fibrinogénom, sialovými kyselinami);

Reumatoidná artritída (proteín obyčajný s proteínovými frakciami, glykoproteínmi, sialovými kyselinami);

Dna (celkový proteín s proteínovými frakciami, kreatinín, kyselina močová, stresové proteíny, glykoproteíny);

Sklerodermia (celkový proteín s proteínovými frakciami, fibrinogén, stresové proteíny, hydroxyprolín).

Patológia biliárneho a gastrointestinálneho systému.

Ochorenie žlčových kameňov (bilirubín s frakciami, alkalická fosfatáza, Y-glutamyltranspeptidáza);

Atrofická gastritída (pepsinogén, gastrín);

Chronická pankreatitída (glukóza, glukózová tolerancia, celkový proteín s proteínovými frakciami, amyláza s izoenzýmami, lipáza v moči av krvi);

Nekróza pankreasu (amyláza);

Dystrofické degeneratívne zmeny v pečeni, mastná forma (močovina, glutamát dehydrogenáza, alanínaminotransferáza, cholínesteráza, aspartátaminotransferáza);

Cirhóza pečene (močovina, cholesterol, aspartátaminotransferáza, kreatinín, alanínaminotransferáza, proteínové frakcie, β lipoproteíny, sedimentárne vzorky);

Chronická hepatitída (rovnaký výskum ako pri cirhóze, plus laktátdehydrogenáza s izoenzýmami, celkový proteín, alkalická fosfatáza);

Hepatitída je akútna (rovnaký výskum ako v chronickej forme, s výnimkou alkalickej fosfatázy a močoviny).

Patológia dýchacieho systému.

Absces pľúc, akútna bronchitída, bronchiálna astma (celkový proteín s frakciami, stresový proteín);

Bronchiektázia (rovnaká, plus fibrinogén);

Chronická pneumónia (celkový proteín s frakciami, stresový proteín, laktát dehydrogenáza s izoenzýmami);

Akútna pneumónia (rovnako ako chronické plus glykoproteíny, sedimentárne vzorky, kyseliny sialové)

Tuberkulóza (celkový proteín s frakciami, stresový proteín, kyseliny sialové, glykoproteín, vzorky sedimentov).

Patológia močového systému.

Zlyhanie obličiek, akútne a chronické (celkový proteín s frakciami, kreatinín, proteín moču, močovina, obsah elektrolytov Na, Cl, K, Ca);

Ochorenie obličiek (rovnaké ako v prípade nedostatočnosti, plus kyselina močová a elektrolyt P, s výnimkou Cl);

Nefrotický syndróm (rovnaký ako pri nedostatočnosti, plus elektrolytový Mg s výnimkou Cl);

Amyloidóza obličiek (rovnako ako pri nedostatočnosti, plus elektrolytový Mg s výnimkou Cl a Y - glutamyltranspeptidázy);

Chronická pyelonefritída (bežný proteín s frakciami, stresové proteíny, alkalická fosfatáza, cholínesteráza, proteín moču, Y-glutamyltranspeptidáza);

Glomerulonefritída (celkový proteín s frakciami, stresové proteíny, močovina, Y-glutamyltranspeptidáza, kreatinín, laktátdehydrogenáza s izoenzýmami, cholinesteráza).

Patológia endokrinného systému.

Diabetes mellitus (glukóza v moči av krvi, inzulín, acetón, cholesterol, beta-lipoproteíny, s pravdepodobnosťou skrytej formy - test citlivosti na glukózu);

Cukrovky bez cukru (glukóza, vazopresín, glukózový tolerančný test);

Hypoparatyroidizmus (alkalická fosfatáza, obsah elektrolytov K a P v krvi a moči);

Hypotyreoidizmus (tyroxín, trijódtyronín, triglyceridy, beta-lipoproteíny, cholesterol, močovina);

Hnisavá tyreoiditída (tyroxín, trijódtyronín, stresové proteíny, celkový proteín s frakciami);

Autoimunitná tyreoiditída (tyroxín, trijódtyronín, absorpcia jódu131 štítnou žľazou, jód viazaný na proteín);

Goiter je endemický (rovnaký ako u autoimunitnej formy tyreoiditídy, plus cholesterolu a močoviny v moči);

Goiterov difúzny, toxický (tyroxín, trijódtyronín, TSH, viazaný jódový proteín, glukóza, močovina, cholesterol).

Ak to lekár považuje za potrebné, okrem hlavných dodatočných laboratórnych testov sú vymenované. (Pozrite sa na liečbu)

Dekódovanie biochemickej analýzy krvi

Čo ukazuje biochemický krvný test?

Krv je jednou z biomateriálov tela. Je prítomný vo všetkých orgánoch a tkanivách. Jeho zloženie zahŕňa látky, ktoré vznikajú počas práce všetkých orgánov. Krvný test pre biochémiu určuje prítomnosť a úroveň jeho zložiek.

Porovnaním údajov diagnostiky a normálnych hodnôt je možné určiť funkčný stav orgánov, určiť charakter patológií vyskytujúcich sa v nich. Pri niektorých chorobách je biochémia krvi jediným spôsobom, ako objektívne potvrdiť diagnózu.

Okrem hlavných (glukóza, hemoglobín, kreatinín, cholesterol a iné), biochemická analýza tiež odhaľuje špecifické ukazovatele (elektrolyty, sérum, reumatoidný faktor a ďalšie) potrebné na diagnostiku endokrinologických a genetických ochorení. Metóda je tiež použiteľná v pediatrii, športovej medicíne na posúdenie funkčného stavu tela detí, športovcov.

Aké sú indikácie biochemickej analýzy krvi?

Často sa biochémia predpisuje pacientom alebo ambulantným pacientom. Vykonáva sa krvný test na diagnostikovanie alebo monitorovanie účinnosti liečby. Lekár individuálne určí zoznam ukazovateľov, ktorých úroveň musí byť stanovená u pacienta. Môže to byť jeden ukazovateľ (napríklad glukóza pri diabetes mellitus) alebo niekoľko indikátorov (napríklad testy pečeňových funkcií - celkový proteín, bilirubín, protrombínový index, ALT, AST - pri hepatitíde).

Indikácie pre štúdiu sú ochorenia:

hepatobiliárny systém;
obličky;
endokrinný systém;
srdce;
muskuloskeletálny systém;
obehový systém;
gastrointestinálneho traktu.

V kombinácii s metódami inštrumentálnej diagnostiky pomáha biochémia krvi pri správnej diagnostike patológie akýchkoľvek vnútorných orgánov.

Ako urobiť krvný test pre biochémiu?

Biochemická analýza skúma venóznu krv. Vezmite biomateriál z periférnych (ulnárnych alebo radiálnych) žíl. Pri obmedzenom prístupe do predlaktia (zlomeniny, popáleniny atď.) Sa krv odoberá z akejkoľvek inej žily (na rukách, nohách, nohách).

Pred absolvovaním analýzy by mal pacient pripraviť:

8 hodín pred darovaním krvi človek nemôže jesť, piť nápoje obsahujúce cukor;
2 dni musíte upustiť od alkoholu a mastných jedál;
v predvečer štúdie sa vyhnite fyzickému a emocionálnemu stresu.

Analýza sa podáva pred medikáciou, pred diagnostickými a terapeutickými postupmi (röntgenové vyšetrenie, fyzioterapia atď.).

Miesto vpichu pokožky sa ošetrí antiseptickým roztokom 96% etylalkoholu alebo peroxidom vodíka. Krv v objeme 5 až 10 ml sa odoberie do sterilnej suchej skúmavky, ktorá sa odošle do štúdie.

Normy biochemickej analýzy krvi (tabuľka)

Norma u dospelých

U detí mladších ako 14 rokov

Celkový bilirubín (tbil)

až 250 µmol / l (novorodenci)

Priamy bilirubin (idbil)

Alkalická fosfatáza (alp)

Lipoproteíny VP (hdl)

Až 6 g / l (počas tehotenstva)

Kyselina močová (kyselina močová)

C-reaktívny proteín (crp)

Antistreptolyzín O (tiež tiež)

Ako rozlúštiť biochemickú analýzu?

Rozlúštenie biochemickej analýzy krvi je porovnaním výsledkov získaných s normami ukazovateľov. Formulár analýzy obsahuje úplný zoznam látok určených biochemickým laboratóriom a ich referenčné hodnoty. Niekedy stačí stanoviť definitívnu diagnózu na základe odchýlky od normy jedného alebo viacerých parametrov. Ale častejšie, aby ste to potvrdili, potrebujete výsledky ďalšieho výskumu. Ďalej sa bude uvažovať, čo znamená odchýlku od noriem hlavných ukazovateľov biochémie krvi, pre ktoré je typická.

Celkový proteín

Celkový proteín je súbor proteínov v krvnej plazme. Jeho hladina pomáha identifikovať choroby vnútorných orgánov a krvi. Indikátor rastie v podmienkach:

dehydratácia tela (zvracanie, hnačka, popáleniny atď.);
akútne a chronické infekcie;
onkologické ochorenia.

Úroveň celkového proteínu klesá s:

nedostatok bielkovín počas pôstu;
ochorenie pečene;
akútne a chronické krvácanie;
tyreotoxikóza.

bilirubín

Bilirubin je žlčový pigment, ktorý vzniká v dôsledku deštrukcie červených krviniek. K metabolizmu dochádza v dôsledku normálneho fungovania pečene. Jeho hladina sa líši podľa ochorení pečene, žlčových ciest, anémie. Bilirubin je voľná a viazaná frakcia. Zvýšenie prvého indikátora nastane, keď:

akútna vírusová, toxická, lieková hepatitída;
bakteriálne poškodenie pečene (leptospiróza, brucelóza atď.);
nádory pečene, primárna biliárna cirhóza;
hemolytickú anémiu.

Zvýšený obsah viazaného bilirubínu je typický pre ochorenia, ktoré narúšajú tok žlče:

ochorenie žlčových kameňov;
nádor pankreasu;
zápalové ochorenia žlčových ciest atď.

enzýmy

Enzýmová aktivita charakterizuje stav vnútorných orgánov. Zvýšený výkon s porážkou organických buniek. Zvýšenie hladiny aminotransferázy ALAT, ALAT nastáva, keď: t

akútna, chronická hepatitída;
nekróza pečene;
infarkt myokardu;
poranenia a ochorenia kostrového svalstva;
cholestáza;
ťažká hypoxia tkaniva.

Zvýšené hladiny laktátdehydrogenázy (LDH) sú typické pre:

infarkt myokardu, obličky;
myokarditída;
rozsiahla hemolýza;
pľúcna embólia;
akútnej hepatitídy.

Vysoké hladiny kreatínfosfokinázy (CPK) sa môžu vyskytnúť, keď:

infarkt myokardu;
nekróza kostrových svalov;
epilepsie;
myozitída a svalová dystrofia.

Močovina patrí do skupiny substrátov - zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorá je syntetizovaná v pečeni. Hladina látky v krvi závisí od filtračnej schopnosti obličiek a od syntetickej funkcie pečene. Dôvody zvýšenia:

ochorenia obličiek (glomerulonefritída, amyloidóza, pyelonefritída, liečba nefrotoxickými liekmi);
kardiovaskulárne zlyhanie;
masívna strata krvi;
popáleniny;
porušenie odtoku moču;
nadmerného príjmu bielkovín.

Dôvody na zníženie hladiny močoviny:

pôst a prísna vegetariánstvo;
otrava jedmi;
tehotenstva;
porušenie syntetickej funkcie pečene.

Kyselina močová

Kyselina močová je konečným produktom metabolizmu určitých proteínov. Jeho hlavná časť sa vylučuje obličkami, zvyšok - výkaly. Zvýšenie hladiny kyseliny močovej v krvi naznačuje nasledujúce stavy: t

zlyhanie obličiek;
leukémie;
lymfóm;
dlhší pôst;
zneužívanie alkoholu;
predávkovaním salicylátmi a diuretikami.

Koľko je biochemický krvný test?

Náklady na biochemické krvné testy závisia od počtu určených parametrov. Cena každého z nich sa pohybuje od 130 do 300 rubľov. Najdrahšou metódou biochemických krvných testov je imunoelektroforéza, ktorej náklady na niektorých klinikách dosahujú 1000 rubľov.

Biochémia a patobiochémia pečene. Biochemická diagnostika ochorenia pečene

Biochemická diagnostika ochorení pečene.

BIOCHEMICKÁ DIAGNOSTIKA ŽIVÝCH CHORÔB.

Stručná informácia o štruktúre pečene.

cytoplazma obsahuje alanínaminotransferázu (ALT), súčasť aspartátaminotransferázy (AST), laktátdehydrogenázy (LDH), súčasť gamaglutamyltranspeptidázy (GGT) a ďalších enzýmov.

V mitochondriách (MX) väčšina AST (približne 70%), glutamátdehydrogenázy (GLDG), alkoholdehydrogenázy a mnohých ďalších sa koncentruje.

Hrubé endoplazmatické retikulum obsahuje cholínesterázu (CE), atď.

V hladkom endoplazmatickom retikule sú glukóza-6-fosfatáza, UDP-glukuronyltransferáza, hem-obsahujúci membránovo viazaný cytochróm P-450 a ďalšie.

lysozomy obsahujú kyslé hydrolázy (kyslá fosfatáza, ribonukleáza atď.), ktoré sú aktivované znížením pH bunky.

Biliárne pólové mikrovlky obsahujú membránovo závislé enzýmy, ako je alkalická fosfatáza (alkalická fosfatáza), 5-nukleotidáza, časť GGT, leucín aminopeptidáza (LAP).

Pečeň sa nazýva centrálne metabolické laboratórium, pretože rovnako účinne premieňa látky pochádzajúce z čriev a metabolických produktov vytvorených v rôznych orgánoch a tkanivách v dôsledku ich vitálnej aktivity. V súčasnosti je známych viac ako 500 metabolických funkcií. Stručne zvážte tie hlavné.

1. Syntetické. Pečeň syntetizuje proteíny, enzýmy, koagulačné faktory, cholesterol, fosfolipidy atď. Hlavná tvorba ketónových telies sa vyskytuje v pečeni.

2. Detoxikovanie pre endogénnej (amoniak, bilirubin, atď.). a exogénne (drogy atď.). Detoxikácia liekov zahŕňa 2 fázy: 1 - modifikáciu liečiv v redoxných reakciách s použitím cytochrómu P 450 a konjugáciu liekov s látkami rozpustnými vo vode pridaním glukurónovej, kyseliny sírovej, glutatiónu atď.

3. Sekrécia - vylučovanie žlče. Prístroj na vylučovanie žlče obsahuje žlčové kanáliky, mikrovily, lyzozómy priľahlé k nim a Golgiho komplex. Mechanizmus vylučovania žlče zahŕňa uvoľňovanie cholesterolu, žlčových kyselín, pigmentov, fosfolipidov vo forme špecifického makromolekulového komplexu - žlčovej micely. Primárne žlčové kyseliny vytvorené v pečeni vstupujú do čreva, kde sa pôsobením črevnej flóry konvertujú na sekundárne žlčové kyseliny. Tieto sa vstrebávajú v čreve a znovu vstupujú do pečene (enterohepatická cirkulácia). Pečeň ich konjuguje s glycínom a taurínom a mení ich na amfifilné zlúčeniny s vysokou schopnosťou emulgovať hydrofóbne zlúčeniny. látky. Všetky procesy, ktoré spôsobujú porušenie pomeru zložiek v žlči (hormonálne, zápalové, atď.), Vedú k porušeniu sekrécie žlče - cholestázy.

4. Exkrécia - vylučovanie žlčou rôznych látok vrátane tuhých látok.

Pečeň sa zúčastňuje na všetkých typoch metabolizmu.

1. Výmena proteínov. Pečeň syntetizuje nasledujúce proteíny:

albumín 100%, fibrinogén

₁-globulíny 90%, faktory zrážania krvi

₂-globulíny 75% (vrátane vitamínu K)

-globulíny 50%, pseudocholínesteráza (CE)

Albumín patrí medzi najľahšie krvné proteíny, OMM 65-70 kD a je syntetizovaný výlučne v pečeni. Albumíny udržujú onkotický tlak, pokles ich obsahu vedie k edému. Ak zníženie koncentrácie albumínu nie je spojené s podvýživou, porušením črevnej absorpcie alebo veľkou stratou proteínu, je to spôsobené výrazným znížením funkcie pečene. Albumíny hrajú dôležitú úlohu pri preprave látok, ktoré sú slabo rozpustné vo vode (hydrofóbne). Takéto látky zahŕňajú bilirubín, cholesterol, mastné kyseliny, rad hormónov a liečiv. Porušenie transportnej funkcie albumínu vedie k mnohým patologickým zmenám.

Pečeň udržuje hladinu aminokyselín, vrátane. cyklický (tyrozín, tryptofán, fenylalanín), neutralizuje amoniak a mení ho na močovinu. Syntéza močoviny je jednou z najstabilnejších funkcií pečene.

2. Výmena lipidov. Syntéza cholesterolu je 90% uskutočňovaná v pečeni a črevách. Významná časť cholesterolu v pečeni sa premieňa na žlčové kyseliny, steroidné hormóny, vitamín D₂. Pečeň premieňa mastné kyseliny s krátkym reťazcom, ktoré sú toxické pre mozog (4-8 atómov uhlíka - kyselina kaprónová, kyselina izovalérová atď.) Na mastné kyseliny s dlhým reťazcom (16-18 atómov uhlíka).

3. Výmena sacharidov. Pečeň udržuje stabilnú úroveň glykémie glykogenézou, glykogenolýzou, glukoneogenézou. Pečeň produkuje inzulínázy - enzýmy, ktoré rozkladajú inzulín, podporuje hladinu kyseliny mliečnej a kyseliny pyrohroznovej.

4. Pigmentový metabolizmus zahŕňa konverziu toxického, v tuku rozpustného nepriameho bilirubínu na netoxickú, vo vode rozpustnú priamu, konjugáciou s kyselinou glukurónovou v hepatocyte. Uvoľňovanie bilirubujúceho glukuronidu môže nastať buď priamou sekréciou do žlčovej kapiláry, alebo inkorporáciou do žlčovej micely.

5. Porfyrínový metabolizmus zahŕňa syntézu hem pozostávajúceho z komplexu protoporfyrínu so železom. Hém je nevyhnutný na syntézu pečeňových enzýmov obsahujúcich hem (cytochrómy atď.). Vrodená abnormalita syntézy hemu v pečeni vedie k ochoreniam - pečeňovej porfýrii.

6. Výmena hormónov. Pri ochoreniach pečene sa pozoruje zvýšenie hladín hormónov, ktoré je spojené s porušením ich vylučovania žlčou alebo narušením normálneho metabolizmu hormónov (nedostatočná deštrukcia). Hladina adrenalínu a noradrenalínu (mediátory sympatického nervového systému), mineralokortikoidného aldosterónu, pohlavných hormónov, najmä estrogénov, tkanivových hormónov serotonínu a histamínu sa zvyšuje.

7. Výmena stopových prvkov. Pečeň syntetizuje proteíny pre transport (transferín) a depozíciu (feritín) železa, je tiež hlavným zásobníkom železa. Pečeň hrá dôležitú úlohu v metabolizme medi: syntetizuje ceruloplazmín, glykoproteín, ktorý viaže až 90% medi v krvi, a tiež absorbuje meď, ktorá sa voľne viaže na albumín z krvnej plazmy a vylučuje prebytočnú meď cez lyzozómy so žlčou do čreva. Pečeň sa zúčastňuje na výmene iných stopových prvkov a elektrolytov.

Hlavné syndrómy pri ochoreniach pečene.
Pri rôznych ochoreniach pečene sú narušené určité typy metabolizmu alebo určité funkcie orgánu. Niektoré ochorenia sú sprevádzané prevládajúcim poškodením pečeňových buniek. iní - primárne porušenie odtoku žlče, atď, takže diagnóza ochorenia pečene je často vykonáva syndromic. V nasledujúcom texte sú opísané hlavné syndrómy (tabuľka 7).

1. Cytolytický syndróm (cytolýza) vzniká ako dôsledok narušenia štruktúry pečeňových buniek, zvýšenia priepustnosti membrán, spravidla v dôsledku zvýšených procesov peroxidácie lipidov (LPO) a uvoľňovania enzýmov do krvi. Pri cytolytickom syndróme vstupujú do krvného obehu cytoplazmatické aj mitochondriálne zložky enzýmov, ale hlavnú úroveň aktivity určujú cytoplazmatické izoenzýmy. Cytolýza sprevádza najmä akútne ochorenia pečene a zvyšuje sa exacerbáciou chronických ochorení. Rozlišujú sa tieto hlavné mechanizmy cytolýzy:

1) toxická cytolýza (vírusová, alkoholická, liečivá);

2) imunitnú cytolýzu, vrát. autoimunitné;

4) hypoxické („šoková pečeň“ atď.);

5) cytolýzu nádoru;

6) cytolýza spojená s nedostatkami výživy a nedostatočnosťou potravín.

Cytolýza nie je identická s nekrózou buniek: počas cytolýzy bunka zostáva živá a schopná rôznych typov metabolizmu, vrátane syntézy enzýmov, preto sa počas cytolýzy môže aktivita enzýmov zvýšiť desiatky alebo stovky krát a dlhodobo zostať zvýšená. Nekróza znamená smrť buniek, takže zvýšenie aktivity enzýmu môže byť významné, ale krátkodobé.

Hlavnými dostupnými markermi cytolýzy pri akútnej hepatitíde sú alanín (ALT) a aspartátové (AST) transaminázy, gama-glutamyltranspeptidáza (GGT), laktátdehydrogenáza (LDH).

Zvýšené ALT a AST pozorované u 88-97% pacientov v závislosti od typu hepatitídy, viac ako polovica z nich je signifikantná (10-100-krát) zvýšenie. Maximálna aktivita je charakteristická pre 2-3 týždne ochorenia a návrat k normálu je 5-6 týždňov. Prekročenie normalizácie aktivity je nepriaznivým faktorom. ALT aktivita> AST, ktorá je spojená s distribúciou AST medzi cytoplazmou a mitochondriami. Prevládajúce zvýšenie AST je spojené s mitochondriálnym poškodením a je pozorované pri závažnejšom poškodení pečene, najmä alkoholu. Aktivita transaminázy sa mierne zvyšuje (2-5 krát) pri chronických ochoreniach pečene, zvyčajne v akútnej fáze a nádoroch pečene. Pre cirhózu pečene nie je zvýšenie aktivity tranamináz spravidla charakteristické.

Gama-glutamyltranspeptidáza (GGT, GGTP, -GT) je obsiahnutý v cytoplazme (izoforma s nízkou molekulovou hmotnosťou) a je spojený s membránami žlčového pólu (izoforma s vysokou molekulovou hmotnosťou). Zvýšenie jeho aktivity môže byť spojené s cytolýzou, cholestázou, intoxikáciou alkoholom alebo drogami, rastom nádoru, preto zvýšenie aktivity GGT nie je špecifické pre konkrétne ochorenie, ale do určitej miery univerzálne alebo skríning ochorení pečene, hoci zahŕňa ďalšie vyhľadávanie príčin ochorenia.

Laktát dehydrogenáza (LDH) sa zvyšuje s mnohými chorobami. Diagnostická hodnota celkovej aktivity je malá a je obmedzená na definíciu vylučujúcu nádorové a hemolytické procesy, ako aj diferenciálnu diagnostiku Gilbertovho syndrómu (normálne) a chronickej hemolýzy (zvýšenej). Pre diagnózu ochorenia pečene významnejšie hodnotenie pečeňového izoenzýmu LDH - LDH₅.

Zvýšenie aktivity jedného alebo všetkých enzýmov indikuje akútne ochorenie pečene, exacerbáciu chronického ochorenia alebo nádorového procesu, ale neindikuje povahu ochorenia a neumožňuje diagnózu.
2. Cholestatický syndróm (cholestáza) je charakterizovaný porušením sekrécie žlče. Niektorí autori identifikujú zriedkavú anekerickú formu cholestázy spojenú so zmenami normálnych pomerov zložiek žlče (hormonálne zmeny, poruchy enterohepatického obehu cholesterolu). Rozoznáva sa intrahepatická cholestáza spojená so zhoršenou sekréciou žlče hepatocytmi alebo tvorbou žlče v žlčovodoch a extrahepatickej cholestáze v dôsledku obštrukcie žlčových ciest kameňom, nádorom alebo podávaním liekov, ktoré spôsobujú cholestázu. Pri cholestáze sa látky, ktoré sa vylučujú žlčou u zdravých ľudí, dostávajú do krvnej plazmy a akumulujú sa v nej, a aktivita tzv. Typická ikterická forma cholestázy je charakterizovaná svrbením a žltačkou.

Cholestasis zvyšuje obsah žlčových kyselín; bilirubínu s prevládajúcim zvýšením konjugovanej časti žlče (cholebilirubínu); cholesterol a -lipoproteíny; enzýmová aktivita alkalická fosfatáza, GGT, 5-nukleotidáza.

Alkalická fosfatáza (alkalická fosfatáza) vykazuje svoju aktivitu pri pH 9-10, je obsiahnutý v pečeni, črevách, kostnom tkanive, ale hlavným vylučovacím orgánom je pečeň. V hepatocyte je alkalická fosfatáza asociovaná s membránami žlčového pólu a epiteliálnymi mikrovlnami žlčových ciest. Príčiny hyperfermentémie sú oneskorená eliminácia enzýmu v žlči a indukcia enzýmovej syntézy v závislosti od bloku enterohepatickej cirkulácie. Zvýšená aktivita pri ochoreniach pečene najčastejšie indikuje cholestázu, pri ktorej sa aktivita enzýmu zvyšuje o 4 až 10 dní až 3-krát alebo viackrát, ako aj nádory pečene. S rastúcou aktivitou alkalickej fosfatázy by mala byť diferenciálna diagnostika s ochoreniami kostí.

5-nukleotidázy Patrí do skupiny alkalických fosfatáz, líši sa súbežne s nimi, ale zvýšenie jej aktivity je spojené výlučne s cholestázou. Nedostatok dostupných komerčných súprav však neumožňuje plne využiť tento ukazovateľ.

GGT Je tiež enzýmom viazaným na membránu a s cholestázou sa zvyšuje v dôsledku aktivácie syntézy. Štúdia GGT s cholestázou sa považuje za povinnú.

Narušenie vylučovania žlče vedie k zhoršenej emulzifikácii tukov ak zníženiu absorpcie tukov rozpustných látok v čreve, vrátane vitamínu K. Zníženie množstva vitamínu K v tele vedie k zníženiu syntézy koagulačných faktorov závislých od vitamínu K a poklesu protrombínového indexu (PTI). Pri intramuskulárnom podaní vitamínu K s cholestázou sa PI za deň zvyšuje o 30%.

3. Hepatodepresívny syndróm zahŕňa akúkoľvek dysfunkciu pečene, ktorá nie je sprevádzaná encefalopatiou. Syndróm sa vyskytuje pri mnohých ochoreniach pečene, ale je najvýraznejší pri chronických procesoch. Na indikáciu syndrómu sa používajú záťažové testy a stanovenie koncentrácie alebo aktivity rôznych zložiek séra alebo plazmy.

Stresové testy sú citlivé, ale zriedka sa používajú. Patrí medzi ne:

a) testy vylučovacej funkcie pečene - bromsulfaleín, indocyanova atď.;

b) testy detoxikačnej funkcie pečene - antipyrínu, kofeínu, Quick sample.

Štúdie ukázali, že syntetická funkcia je najmenej stabilná pri ochoreniach pečene a syntéza týchto látok, ktoré sa tvoria hlavne v pečeni, sa v prvom rade znižuje. Dostupné a informatívne indikátory hepatodekrécie sú nasledovné:

1. Albumín takmer úplne syntetizovaný v pečeni. Zníženie jeho koncentrácie je pozorované u polovice pacientov s akútnym a 80-90% pacientov s CAH a cirhózou pečene. Hypoalbuminémia sa vyvíja postupne, výsledkom môže byť pokles onkotického krvného tlaku a edému, ako aj zníženie viazania hydrofóbnych a amfifilných zlúčenín endogénnej a exogénnej povahy (bilirubín, voľné mastné kyseliny, liečivá atď.), Ktoré môžu spôsobiť intoxikačné javy. Informatívne paralelné stanovenie albumínu a celkového proteínu. Celkový obsah proteínov zostáva spravidla normálny alebo sa zvyšuje v dôsledku imunoglobulínov (Ig) na pozadí poklesu koncentrácie albumínu. Redukcia albumínu na 30 g / l alebo menej naznačuje chronický proces.

2. -1-antitrypsín - glykoproteín tvoriaci 80 až 90% frakcie ₁-globulín, proteín akútnej fázy, syntetizovaný v pečeni, je citlivým indikátorom zápalu parenchymálnych buniek. Výnimočný diagnostický význam spojený s vrodeným nedostatkom proteínov, ktorý vedie k závažným formám poškodenia pečene a ďalších orgánov u detí.

3. Cholínesteráza (pseudo-cholinesteráza, butyrylcholinesteráza - HE, BChE), syntetizované v pečeni, označuje₂-globulíny. Jednou z ich funkcií je rozdelenie svalových relaxancií odvodených od sukcinyl dicholínu (listenon, ditilin). Nedostatok enzýmu alebo výskyt atypických foriem komplikuje rozpad liečiv, čo komplikuje proces zotavenia z anestézie. Na prevenciu pooperačných komplikácií sa odporúča stanoviť aktivitu enzýmu a číslo dibukaínu, t. stupeň inhibície enzýmu dibucain. Pri chronických procesoch, najmä cirhóze pečene, aktivita enzýmu klesá a stupeň redukcie má prognostickú hodnotu. Ďalším dôvodom poklesu aktivity je otrava organofosfátom.

4. Fibrinogén, I koagulačný faktor, proteín akútnej fázy, označuje ₂-globulíny. Hladina fibrinogénu prirodzene klesá so závažnými chronickými a akútnymi ochoreniami pečene.

5. PTI znižuje v dôsledku zhoršenej syntézy koagulačných faktorov závislých od vitamínu K (II, VII, IX, X). Na rozdiel od cholestázy nie je hladina IPT normalizovaná intramuskulárnym podávaním vitamínu K. IPT je ukazovateľom závažnosti akútnej dysfunkcie pečene.

6. Cholesterol poklesy krvi u pacientov s chronickou hepatitídou a cirhózou pečene, častejšie s subakútnym variantom priebehu. V tukovej pečeni sa hladiny cholesterolu môžu zvýšiť.

Pri chronických ochoreniach pečene vo fáze kompenzácie je zvýšenie aktivity enzýmu netypicky. Mierne zvýšenie (faktorom 1,5–3) pri transaminázovej aktivite s vyššou hladinou AST však naznačuje poškodenie subcelulárnych štruktúr, najmä MX.

4. Mezenchymálny zápalový syndróm je spôsobený poškodením mezenchýmu a strómy pečene, je to v podstate imunitná reakcia na antigénnu stimuláciu črevného pôvodu. Tento syndróm sprevádza akútne aj chronické ochorenia pečene. Markery syndrómu sú glob-globulíny, imunoglobulíny, test tymolu, protilátky proti bunkovým elementom atď.

definícia -globulíny odkazuje na povinné testy na pečeň. Nárast -globulínov, ktoré sú v podstate imunoglobulínmi, je charakteristický pre väčšinu ochorení pečene, ale je najvýraznejší v CAG a cirhóze pečene. Nedávno sa ukázalo, že beta-globulíny môžu byť produkované Kupfferovými bunkami a plazmatickými bunkami zápalových infiltrátov pečene. Pri cirhóze pečene na pozadí nízkej koncentrácie albumínu v dôsledku porušenia syntetickej funkcie pečene je pozorovaný významný nárast a-globulínov, zatiaľ čo koncentrácia celkového proteínu môže zostať normálna alebo zvýšená.

Imunoglobulíny (Ig) sú proteíny zahrnuté do frakcie -globulínu a majú vlastnosti protilátok. Existuje 5 hlavných tried Ig: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE, ale prvé tri sa používajú na diagnostiku. Pri chronických ochoreniach pečene sa zvyšuje obsah všetkých tried Ig, ale rast IgM je najvýraznejší. Pri alkoholickom poškodení pečene sa pozorovalo zvýšenie IgA.

Thymolový test - nešpecifická, ale cenovo dostupná výskumná metóda, ktorej výsledok závisí od obsahu IgM, IgG a lipoproteínov v sére. Test je pozitívny u 70-80% pacientov s akútnou vírusovou hepatitídou v prvých 5 dňoch ikterického obdobia, u 70-80% pacientov s CAH av 60% s cirhózou pečene. Vzorka je normálna pri obštrukčnej žltačke u 95% pacientov.

Protilátky proti tkanivovým a bunkovým antigénom (jadrové, hladké svalstvo, mitochondriálne) umožňujú identifikovať autoimunitné zložky pri ochoreniach pečene.

Ďalšie výskumné metódy zahŕňajú definíciu haptoglobínu, orozomukoidy, ₂-makroglobulín, ₂-mikroglobulín, hydroxyprolín, urónové kyseliny.
Tabuľka 1.

Biochemická diagnostika chorôb

Biochemická diagnostika Biochemická diagnostika (klinická chémia (biochémia), patochémia) - smer klinickej laboratórnej diagnostiky, ktorej cieľom je monitorovať stav pacienta a diagnostikovať ochorenia identifikáciou chemických zložiek v biomateriáli (krv, moč, v niektorých prípadoch výkaly, pleurálna alebo mozgovomiechová tekutina),

Krvná plazma je tekutina organizmu, ktorá má komplexné chemické zloženie, vrátane veľkého množstva anorganických iónov, enzýmov, hormónov, proteínov, lipidov a sacharidov, ako aj rozpustených plynov - oxidu uhličitého a kyslíka. Koncentrácia všetkých zložiek krvi u zdravého človeka je v rámci určitých limitov, čo odráža normálny funkčný stav organizmu ako celku, ako aj každej z jeho buniek oddelene. V prípade rôznych ochorení dochádza k porušeniu funkcií orgánov a systémov, čo vedie k nerovnováhe a koncentrácii jednej alebo viacerých zložiek krvi. Chemická analýza krvi v procese diagnózy je založená na tomto princípe. Zoznam patologických stavov, v ktorých je nevyhnutná biochemická analýza krvi a moču, je pomerne široký a zahŕňa ochorenia kardiovaskulárneho, endokrinného, respiračného, vylučovacieho a iných systémov. Choroby vyplývajúce z podvýživy sú tiež diagnostikované pomocou biochemických krvných testov. Nedostatky v potrave je možné zistiť pomocou laboratórnych diagnostických metód.

Špecifické látky môžu byť tiež uvoľňované do krvného obehu niektorými typmi nádorových buniek. Úloha biochemických laboratórií pri monitorovaní a diagnostikovaní rakoviny je obmedzená na meranie krvných hladín týchto „nádorových markerov“.

Bezpečnosť a účinnosť liekovej terapie závisí od merania koncentrácie liečiv v krvi. A to je len jeden aspekt obrovskej úlohy biochemickej diagnostiky pri monitorovaní liečby pacientov.

Väčšina testov krvi a moču sa dnes vykonáva pomocou moderných high-tech automatizovaných diagnostických systémov, ktorých biochemické analyzátory umožňujú vykonávať až 1000 testov za 1 hodinu, až 20 alebo viac na každú vzorku. Výsledok diagnózy väčšiny testov sa dostane do 12-24 hodín. Väčšina laboratórií vykonáva špecifický zoznam testov nepretržite, pretože pri urgentnej diagnostike musia byť výsledky testov hotové do 1 hodiny.

TAT (alebo rýchlosť laboratórnej diagnostiky) je čas od momentu, keď je test priradený času, kedy bol výsledok testu prijatý, alebo od času, kedy bol materiál odobratý do času, kedy bol výsledok testu prijatý. TAT by mal zodpovedať rýchlosti vývoja patologického procesu, ako aj možnosti farmakologickej alebo inej korekcie.

Niektorí pacienti na oddeleniach, jednotkách intenzívnej starostlivosti a jednotkách intenzívnej starostlivosti často potrebujú neustále monitorovanie určitých krvných parametrov. Za týchto podmienok môže sestra tohto oddelenia vykonať určitý obmedzený zoznam testov s použitím potrebného zariadenia umiestneného v oddelení.

KAPITOLA 4 BIOCHEMICKÁ DIAGNOSTIKA PATOLOGICKÝCH PROCESOV A HEREDITÁRNYCH CHORÔB t

4.1. KARDIOVASKULÁRNA PATOLÓGIA

V oblasti kardiovaskulárnej patológie dosiahla klinická biochémia najväčší úspech v diagnostike infarktu myokardu. Metódy klinickej enzymológie a imunochémie umožňujú diagnostikovať infarkt myokardu v prvých hodinách jeho výskytu, identifikovať klinický stav nestabilnej angíny, vykonať diferenciálnu diagnostiku ťažkej angíny (ischémie) a odumretia myocytov (anoxia), vyhodnotiť účinnosť trombolytickej terapie a fenoménu reperfúzie.

V súlade s odporúčaniami WHO je diagnóza infarktu myokardu založená na typickom klinickom obraze záchvatu bolesti na hrudníku; Zmeny EKG; zvýšenie krvnej aktivity kardiošpecifických enzýmov (markerov).

Súčasne s opakovaným infarktom myokardu, kardiosklerózou a atriálnou fibriláciou, ako aj v prítomnosti kardiostimulátora u pacienta je oveľa ťažšie diagnostikovať infarkt myokardu podľa údajov EKG. Okrem toho viac ako 25% pacientov, u ktorých sa potvrdil infarkt myokardu pri pitve, nemalo zmeny EKG. Podľa prospektívnej štúdie uskutočnenej v Spojených štátoch sa diagnóza infarktu myokardu bez štúdie kardiošpecifických markerov smrti myocytov môže uskutočniť len v 25% prípadov.

Medzi pacientmi, ktorí sa dostali na jednotku intenzívnej starostlivosti so srdcovou bolesťou, má iba 10-15% infarkt myokardu. Potreba diagnostikovať infarkt myokardu v skorých štádiách je diktovaná skutočnosťou, že trombolytická liečba v prvých 2-6 hodinách znižuje včasnú mortalitu v priemere o 30% a liečba začala v 7-12 hodinách - len o 13%. Trombolytická terapia po 13-24 hodinách neznižuje mortalitu.

Včasná diagnostika infarktu myokardu vám umožňuje aplikovať a transluminálnu angioplastiku a účinnosť konzervatívnej liečby je vyššia, ak sa začne čo najskôr.

Je tiež potrebné vykonať diferenciálnu diagnostiku infarktu myokardu s nestabilnou angínou, keď včasná liečba môže zabrániť infarktu myokardu.

V posledných rokoch bol arzén biochemických markerov smrti myocytov doplnený o nové vysoko špecifické testy, ktoré vám umožnia diagnostikovať infarkt myokardu v prvých hodinách jeho výskytu. Ide o testy, ktoré je možné aplikovať v prvej fáze lekárskej starostlivosti, ako aj stanovenie kardiošpecifických izoenzýmov a proteínových markerov pre smrť myocytov používaných na jednotke intenzívnej starostlivosti zdravotníckych zariadení. Úspech priemyselnej technológie a uvoľňovanie diagnostických systémov založených na princípe "suchej chémie" umožňuje zároveň určiť špecifické markery smrti myocytov v prvej fáze lekárskej starostlivosti. Avšak aj za týchto podmienok sú možné diagnostické chyby, ak patofyziológia infarktu myokardu a mechanizmy prijímania orgánovo špecifických a nešpecifických proteínových markerov smrti myocytov do krvi nie sú jasne pochopené.

Lokalizácia v bunke má významný vplyv na rýchlosť uvoľňovania markera z poškodeného myocytu. Cytosolové enzýmy sa uvoľňujú rýchlejšie ako tie, ktoré sú štruktúrované na intracelulárnych membránach. Na rozdiel od cytozolických markerov sa vyžaduje uvoľnenie intracelulárneho kontraktilného aparátu, aby sa dosiahol intersticiálny priestor proteínov príbuzných so štruktúrou, čo spomaľuje proces vzniku markerov v krvi; tieto sú uvoľnené mitochondriálne enzýmy.

V štúdii srdcových markerov infarktu myokardu je potrebné brať do úvahy množstvo ustanovení, označovaných ako princípy diagnózy infarktu myokardu. Tieto zahŕňajú: 1) časové intervaly; 2) štúdium markerov poškodenia myokardu v dynamike; 3) orgánová špecifickosť laboratórnej diagnostiky infarktu myokardu; 4) komplexný charakter diagnózy; 5) koncept „šedej zóny“.

Praktický význam markerov myocytov smrti - koncentrácia katalyzátora v krvnom CK, LDH, AST, glykogén fosforylázu (GP), zvýšenie hladín myoglobínu, myozínu reťaz, troponín T I. K porážke iba kardiomyocytov-ing (ale nie kostrového svalstva myocytov) špecifické definície koncentrácia v krvi izoenzým CK-MB a LDH₁, imunochemické stanovenie CK-MB a GF-BB, ako aj pomer izoforiem izoenzýmu CK-MB a troponínov.

V diagnóze infarktu myokardu je dôležité zvážiť čas, ktorý uplynul od nástupu angíny. Je to spôsobené tým, že od okamihu smrti myocytov k objaveniu sa markerov v krvi prechádza pomerne dlhé obdobie. Výtok z buniek veľkých proteínových molekúl (CC a LDH) sa môže vyskytnúť len vtedy, ak je narušená integrita plazmatickej membrány myocytov v dôsledku ich smrti počas anoxie. Menšie molekuly proteínových markerov (myoglobín, troponín) môžu v malých množstvách vypršať v bunkách a za podmienok predĺženej hypoxie s výraznými zmenami v membráne myocytov pred deštrukciou buniek. V prvých 4 hodinách po oklúzii koronárnej artérie v zóne maximálnej ischémie sa približne 60% myocytov nekrotizovalo; nekróza zvyšných 40% nastane v priebehu nasledujúcich 20 hodín.

Pri prekročení membrány myocytov molekuly proteínu vstupujú do extracelulárnej tekutiny a prúdia zo srdca len cez lymfatické kanály. To určuje pomerne dlhú dobu (3-6 hodín) od času smrti myocytov po objavenie sa kardiošpecifických markerov v krvi. V prvom rade sa zvyšuje obsah myoglobínu, GF-BB a troponínu v krvi, potom KK a kardiošpecifický izoenzým KK-MB, AST; signifikantne neskôr zvyšuje aktivitu LDH a srdcovo špecifického izoenzýmu LDH₁ (Obr. 4.1). Klinická senzitivita kardiospecifických markerov do značnej miery závisí od času, ktorý uplynul od smrti myocytov. V prípade KK-MB je teda pri detekcii krvi počas prvých 3 - 4 hodín po záchvate anginy pectoris klinická senzitivita (presnosť diagnostiky) iba 25-45% a zvyšuje sa na 98% v rozsahu 8-32 hodín.

Obr. 4.1. Dynamika aktivity enzýmu pri infarkte myokardu. 1 - MW-2 / MW-1; 2 - MM-3 / MM-1; 3 - KK-MB; 4 - celkový KK; 5 - LDH₁/ LDG₂

CK dáva falošne negatívne výsledky v 32% prípadov, AST - v 49%, myoglobín - v 15%. Aktivita LDH je spoľahlivým markerom smrti myocytov po 12 hodinách od nástupu angínového ataku, ale zostáva zvýšená počas 10-12 dní. Údaje o aktivite kardiošpecifických markerov v termínoch kratších ako 4 až 6 hodín po ataku angíny pectoris môžu viesť k diagnostickým chybám, keď ani pri rozsiahlom infarkte myokardu nie sú markery smrti myocytov také informatívne. Okrem toho rýchlosť zvýšenia obsahu srdcových markerov v krvi do značnej miery závisí od trvania ischémie a času rekanalizácie trombozómovej koronárnej artérie a reperfúzie myokardu po srdcovom infarkte.

Druhým znakom uvoľňovania markerov smrti kardiomyocytov do krvi je charakteristická dynamika nárastu a poklesu ich koncentrácie (katalytická koncentrácia). Toto je určené konštantnou kontrakciou myokardu, ktorá vedie najprv k rýchlej eliminácii proteínov z nekrotizovanej oblasti myokardu a potom k úplnému vylúhovaniu markerových proteínov do krvného obehu. Len pri infarkte myokardu sa obsah markerov smrti kardiomyocytov v krvi zvyšuje v rozmedzí 8 až 24 hodín, v prípade nekomplikovaného infarktu myokardu dochádza k podobne výraznej eliminácii markerových proteínov z cievneho lôžka. Zároveň obsah každého zo značiek „zapíše“ oblúkovú dynamickú krivku s rôznymi časovými parametrami. Pre väčšinu markerov poskytuje plocha krivky predstavu o rozsahu infarktu myokardu, ktorý odráža množstvo nekrotického tkaniva myokardu. Aktivita CC a CC-MB v krvi sa zvyšuje už pri smrti 1 g tkaniva myokardu.

Jedna štúdia AST, LDH, CK, alebo má relatívne nízku klinickú špecificitu - 66% zvýšenie aktivity enzýmu alebo obsah markerových proteínov, po dobu 3-4 hodín zlepšuje orgánov diagnostika 86%, tretí rozmer umožňuje diagnostikovať infarkt myokardu, aj pri použití takého testu nie je špecifická, definícia AST. Dynamická štúdie svalových markerov bunkovej smrti umožňuje diferenciálnu diagnostiku medzi infarktom myokardu a giperfermentemii s masívnou porážky priečne pruhovaného svalstva. Pokiaľ ide o 8-24 hodín po záchvate aktivity enzýmov je tak zjavné, že pokiaľ nie je dynamický rast ich činnosti v krvi, nie je tam žiadny infarkt myokardu.

Absolútne špecifické markery poškodenia kardiomyocytov neboli nájdené. Špecifickosť orgánov v diagnóze pomocou izoenzýmov QA je založená len na rozdiele v percentuálnom pomere izoenzýmov v jednotlivých orgánoch a tkanivách a následne v krvnom sére, keď sú poškodené.

Hodnota CK-MB. CK-MB izoenzým je špecifická pre myokardu nie preto, že v iných tkanivách, ako izoenzým nie, ale vzhľadom k jeho aktivite v kardiomyocytov je 15 až 42% z celkovej aktivity CK, pričom jeho obsah nie je v kostrovom svale väčší ako 4%, a to iba v červenej farbe, pomalé škubnutí svalových vlákien. Za týchto podmienok, s léziami myokardu a svalovej svalová aktivita QC môže byť zvýšená v rovnakej miere, ale percento aktivity CK-MB sa výrazne líšia. Infarkt myokardu CK-MB obsah nepresahuje 6% celkovej aktivity CK alebo 12 IU / l pri 30 ° C

Ako v patológii kostrových svalov, tak aj pri úmrtí kardiomyocytov v krvi sa aktivita KK-MB zvyšuje, ale v prvom prípade jeho aktivita neprekročí 6% aktivity KK av druhom prípade sa zvýši na 12-20%. Odporúča sa súčasne vyjadriť aktivitu QC-MB v jednotkách 1 liter (IU / l) a ako percento aktivity QC. Stanovenie aktivity KK-MB zostáva najobľúbenejším testom v diagnóze infarktu myokardu. Pri infarkte myokardu u starších pacientov môže byť aktivita QC zvýšená len v malom rozsahu, ale s významným zvýšením aktivity QC-MB. U takýchto pacientov je diagnosticky dôležité skúmať aktivitu CK-MB, a to aj pri nevýznamnom zvýšení aktivity CK.

Počas operácií na srdci (srdcové defekty, chirurgia bypassu koronárnych artérií) sa QC-MB aktivita používa na diagnostiku pooperačného infarktu myokardu. Bezprostredne po chirurgickom zákroku v dôsledku hypoxie a poškodenia myokardu sa aktivita KK-MB v krvi zvyšuje a vracia sa do normálu v priebehu 10-12 hodín, s rozvojom infarktu myokardu sa aktivita KK-MB zvyšuje výraznejšie a má dynamiku charakteristickú infarktu myokardu.

Hodnota LDH. Aktivita LDH₁ charakteristika myokardu ako tkaniva s anaeróbnym typom výmeny. Za podmienok hypertrofie myokardu a chronickej hypoxie, syntéza LDH₁ u kardiomyocytov sa začína zvyšovať. Pri infarkte myokardu dochádza k zvýšeniu katalytickej koncentrácie LDH v krvi v dôsledku zvýšenia

obsah izoenzýmov LDH₁ a LDH₂ v pomere LDH₁/ LDG₂ viac ako 1. LDH - cytozolický enzým; Významné zvýšenie aktivity LDH v krvi počas infarktu myokardu sa vyskytuje neskôr ako QC a AST, počas 1 dňa oblasť ataku angíny; vysoká aktivita LDH₁ pretrváva 12-14 dní. Ako test sa používa pokles aktivity LDH v krvi na normálne, čo indikuje ukončenie obdobia resorpcie nekrotizovaného tkaniva myokardu. Ak je aktivita LDH₁, Stanovená priamou metódou, s inhibíciou podjednotky M protilátkami presahuje 100 IU / l, je to spoľahlivý znak infarktu myokardu.

Na rozdiel od izoenzýmov M podjednotky a LDH₃ (MMNN) LDH₄ (HMMM) a LDH₅ (MMMM) podjednotka H a LDH izoenzým₁ (IUUH) v menšom rozsahu LDH₂ (НННМ), môže ako substrát použiť nielen laktát a pyruvát, ale α-hydroxybutyrát. To bolo základom návrhu na hodnotenie aktivity LDH₁ v krvi s použitím a-hydroxybutyrátu ako substrátu; zatiaľ čo izozým LDH₁ označované ako a-hydroxybutyrát dehydrogenáza (a-HBDG). Pri infarkte myokardu poskytuje štúdia aktivity celkového LDH a a-HBDG podobné výsledky. Ak sa aktivita LDH v krvi zvýši v dôsledku iného patologického procesu, aktivita LDH bude významne vyššia ako aktivita LDH.₁ a a-HBDG v neprítomnosti dynamiky charakteristickej infarktu myokardu.

Pri infarkte myokardu nedošlo k signifikantnej korelácii medzi aktivitou KK-MB a LDH.₁ vo všetkých termínoch infarktu, ku ktorému dochádza v dôsledku významného rozdielu v dynamike a načasovaní zvýšenia aktivity týchto izoenzýmov v krvi.

Molekuly enzýmov, ktoré vstúpili do krvi po smrti kardiomyocytov, sú patologické zložky krvnej plazmy, a preto musia byť odstránené. V závislosti od veľkosti markerových molekúl sa niektoré proteíny, napríklad myoglobín, vylučujú do moču alebo do fagocytových buniek monocytového makrofágového systému. Avšak predtým, ako sú molekuly CK-MB a CK-MM fagocytované makrofágmi, prechádzajú sekvenčným účinkom proteáz v krvi, čo vedie k tvorbe izoenzýmov CK-MB a CK-MM.

V myocytoch je izoenzým KK-MM reprezentovaný jednou formou MM-3. V krvi karboxypeptidáza postupne štiepi konečné aminokyselinové zvyšky lyzínu z každého z dvoch monomérov, pričom postupne tvoria izoformy MM-2 a MM-1. Stanovenie izoforiem KK-MM a KK-MB metódou EF a výpočet ich pomeru

až do 1 hodiny, aby sa stanovil čas smrti kardiomyocytov. Pomer izoforiem MM a MB sa mení pred zvýšením aktivity KK-MB.

Enzymodiagnostika infarktu myokardu v klinických diagnostických laboratóriách je zložitá. Najprv sa stanoví aktivita AST, KK a LDH, potom sa skúma aktivita KK-MB a LDH₁. Integrovaný prístup k enzýmovej diagnostike je spôsobený v prvom rade skutočnosťou, že pri skúmaní aktivity jedného enzýmu sa môže vyskytnúť chyba; po druhé, každý z týchto enzýmov sa líši v diagnostickom význame a dynamike (doba výskytu v krvi a rýchlosť vylučovania z cievneho lôžka). Okrem nepresností, ktoré sa môžu vykonať pri preanalytickej (odbere krvi na analýzu) a analytických fázach, existujú objektívne dôvody, ktoré ovplyvňujú výsledky stanovenia aktivity enzýmov. Ťažkosti vznikajú, keď sa infarkt myokardu vyvíja na pozadí závažných somatických ochorení, s infarktom myokardu komplikovaným kardiogénnym šokom, so septikémiou.

Napriek klinickej špecificite aktivity QC pre infarkt myokardu (98%), v niektorých prípadoch nie je možné zvýšiť aktivitu QC a QC-MB ani v podmienkach overovania diagnózy infarktu myokardu podľa EKG údajov. K tomu dochádza v prípadoch, keď sa infarkt vyvíja na pozadí zlyhania obličiek a akumulácie uremických toxínov (stredne molekulárne peptidy), u pacientov s cirhózou pečene a nedostatočnou detoxikačnou aktivitou hepatocytov, so septikémiou a endogénnou intoxikáciou, s výraznou metabolickou (alebo respiračnou) acidózou. Za týchto podmienok sa v krvi akumuluje také veľké množstvo nešpecifických inhibítorov, že aktivita QC a QC-MB je prakticky neurčená. V takýchto prípadoch je možné stanoviť aktivitu QC len po postupe riedenia séra v klinickej biochémii, keď pokles koncentrácie inhibítorov umožňuje, aby sa aktivita enzýmu prejavila.

Prítomnosť inhibítorov KK a KK-MB v krvi podnietila vývoj imunochemickej metódy na stanovenie katalytickej aktivity v krvi, ale obsah KK-MB molekulovou hmotnosťou tejto formy. To významne zlepšilo citlivosť metódy a reprodukovateľnosť výsledkov. Hoci s nekomplikovaným infarktom myokardu, aktivita KK-MB a obsah proteínu KK-MB dobre korelujú,

je možné stanoviť obsah QC-MB v krvi o niekoľko hodín skôr, ako je enzým aktívny. Významný nárast hladiny CK-MB proteínu v krvi bol zaznamenaný u polovice pacientov už po 3 hodinách a 6 hodín po atakovaní angíny pectoris bola zaznamenaná vysoká hladina proteínu u všetkých pacientov s klinickým obrazom infarktu myokardu. Už 90 minút po trombolýze sa hladina KK-MB proteínu v krvi niekoľkokrát zvyšuje. U pacientov s nestabilnou angínou je častejšie zaznamenané zvýšenie obsahu proteínu CC-MB ako zvýšenie aktivity izoenzýmu. Súčasne, napriek výrobe diagnostických súprav od rôznych spoločností, nebola otázka štandardizácie metódy určovania počtu QC-VM konečne vyriešená.

Hodnota glykogénfosforylázy. Medzi enzýmovými a izoenzýmovými markermi v diagnostike infarktu myokardu určujú klinickí biochemici aktivitu GF a jeho izoenzýmu GF-BB. GF je cytozolický enzým, ktorý katalyzuje odstránenie glukózy z glykogénu v bunke.

V ľudských tkanivách existujú tri GF izoenzýmy: GF-LL v pečeni, GF-MM v myocytoch a GF-BB v mozgovom tkanive. V ľudskom myokarde sú izoenzýmy GF-BB a GF-MM, v myocytoch kostrových svalov - len GF-MM. GF-BB je najcitlivejším testom na diagnostiku infarktu myokardu v prvých 3-4 hodinách po atakovaní angíny. Podľa diagnostickej citlivosti v prvých hodinách možno stanovenie aktivity GF porovnať len so stanovením hmotnosti KK-MB v krvi. U väčšiny pacientov sa hladina GF-BB významne zvýšila už po 4 hodinách po ataku angíny a nekomplikovaný infarkt myokardu sa vrátil do normálu v priebehu 48 hodín.

Hodnota myoglobínu. Z proteínových markerov infarktu myokardu je najčastejšie používanou definíciou v krvi obsah myoglobínu (MG). MG je chromoproteín, ktorý v cytosóle všetkých svalových buniek transportuje kyslík hlavne do mitochondrií. Molekulová hmotnosť MG je len 18 kD; jeho vlastnosti sú podobné u myocytov kostrových svalov a kardiomyocytov. MG je stále prítomný v krvnej plazme v koncentrácii pod 80 ng / ml. Pri infarkte myokardu stúpa hladina MG v krvi 10-20 krát.

• Zvýšenie MG v krvi - najskorší test diagnózy infarktu myokardu; zvýšenie hladiny MG v krvi je možné stanoviť po 3-4 hodinách po atakovaní angíny. Toto je prvá diagnostická hodnota MG.

• Druhým znakom MG v diagnóze infarktu myokardu je, že takáto malá molekula voľne prechádza cez filtračnú bariéru obličkových orgánov a rýchlo končí v moči. To určuje povahu zmien v obsahu MG v krvi: rýchlo rastie a klesá rovnako rýchlo. Len pri stanovení MG je možné diagnostikovať rekurentné infarkty myokardu (obr. 4.2), ktoré sa vyvíjajú niekoľko hodín po prvej epizóde smrti kardiomyocytov. Okrem toho sa v rade klinických pozorovaní pozorovali významné fluktuácie hladiny MG v krvi v prvý deň infarktu myokardu, keď výrazný nárast v priebehu niekoľkých hodín spôsobil rovnako výrazný pokles. Β V niektorých situáciách hladina MG v krvi zostáva dlhodobo stále vysoká. Toto sa pozoruje pri kardiogénnom šoku, keď zníženie kontraktilnej funkcie vedie k hypotenzii, poklesu hydrostatického tlaku cez renálnu membránu a ukončeniu

Obr. 4.2. Dynamika koncentrácie myoglobínu v krvi po opakovanom atakovaní angíny pectoris

glomerulárnou filtráciou, keď MG nie je možné filtrovať do moču. Zároveň existuje pozitívna korelácia medzi obsahom MG v krvi pozitívne koreluje so zvýšením hladiny kreatinínu.

Hlavnou konštrukčnou kontraktilnou jednotkou myocytu je sarkomér, ktorý je tvorený usporiadanými usporiadanými hrubými a tenkými vláknami. Tenké vlákna obsahujú aktín a komplex troponín-tropomyozín.

Hodnota troponínu. Regulačný komplex troponínu v priečne pruhovaných svaloch pozostáva z troch polypeptidov; V diagnóze infarktu myokardu sa v krvi stanovuje obsah len troponínu T (Tn T) a troponínu I (Tn I). Každý proteín má tri izoformy, ktorých syntéza je kódovaná tromi rôznymi génmi. Izoformy myokardu Tn T a Tn I (srdce Tn T a srdce Tn I) sa používajú ako špecifické markery smrti kardiomyocytov.

Stanovenie obsahu Tn T umožňuje diagnostiku infarktu v časnom aj neskorom období. Obsah Tn T v krvi stúpa po niekoľkých hodinách po záchvate angíny. V počiatočných štádiách infarktu myokardu je klinická senzitivita stanovenia obsahu myoglobínu a KK-MB vyššia ako Tn T, ale od tretieho dňa dosahuje hladina Tn plató, ktorá pretrváva s postupným poklesom počas 5-6 dní. Hladina Tn sa ukázala byť vysoká v obdobiach nekomplikovaného infarktu myokardu, keď sa hladina myoglobínu a aktivity KK-MB už vrátila do normálu a v krvi zostáva len vysoká aktivita LDH.₁. V niektorých prípadoch, keď sa určuje Tn T, diagnóza infarktu myokardu sa môže uskutočniť neskôr - 8-10 dní po anginóznej bolesti. Je zvlášť dôležité skúmať TI u pacientov, ktorí boli prijatí do nemocnice 2-3 dni po atakovaní angíny, keď sa indikátory KK a KK-MB už môžu vrátiť na svoju pôvodnú normálnu úroveň. Okrem toho sa v porovnaní s KK a KK-MB zväčšuje obsah TnT v krvi, čo charakterizuje vyššiu diagnostickú citlivosť stanovenia obsahu Tn T v krvi.

Porovnávacia štúdia Tn T a Tn I ukázala vyššiu diagnostickú senzitivitu Tn I. Hladina Tn I v krvi počas infarktu myokardu môže byť teda takmer 100-krát vyššia ako horná hranica normálu. Pri malom infarkte myokardu stúpa hladina Tn I v krvi vo väčšej miere ako aktivita CC,

Tabuľka 4.1. Porovnávacie charakteristiky markerov srdcového séra

a Percento alebo pomer QC-MB / celkom. QC 6 Čas od začiatku bolestivého záchvatu závisí od metódy

KK-MB a LDG₁. Definícia oboch foriem Tn T a Tn I je výhodná v diagnóze infarktu myokardu, ktorý sa vyvíja v pooperačnom období a po aktívnych resuscitačných opatreniach.

Neexistuje žiadny ideálny marker stavu kardiomyocytov (tabuľka 4.1). V diagnostike infarktu myokardu majú klinickí biochemici tendenciu používať najviac orgánovo špecifické izoenzýmy a identifikovať proteínové markery obsahujúce len bunky myokardu. Avšak pre diagnózu infarktu myokardu v laboratóriách naďalej určovať a MG. Pri nekomplikovanom infarkte myokardu však dynamika nešpecifického MG v krvi prakticky opakuje kardiošpecifický CC-MB, ktorý je 4 až 6 hodín pred ním a súčasne neboli úspešné pokusy určiť obsah MG v moči na diagnostiku infarktu myokardu.

4.2. ŽIVÉ CHOROBY

Napriek mnohým biochemickým procesom v pečeňových bunkách nie všetky majú diagnostickú hodnotu. Je to spôsobené obmedzenými metodickými schopnosťami laboratória, nízkou úrovňou znalostí o patofyziológii pečene, ako aj jednosmernými zmenami v mnohých biochemických testoch.

Dominantnou hodnotou v laboratórnej diagnostike ochorenia pečene je stanovenie aktivity enzýmu. Enzýmy syntetizované hepatocytmi a epitelovými bunkami žlčových ciest môžu byť rozdelené na indikátorové, sekrečné a vylučovacie. Sekrečné enzýmy zahŕňajú cholesterázu, jej aktivita v krvi pri ochoreniach pečene klesá v dôsledku porušenia jej syntézy. Enzýmy vylučovania zahŕňajú alkalickú fosfatázu, GGT a PAWS. Najväčšou skupinou diagnosticky významných enzýmov sú indikátorové enzýmy vrátane ALT, AST, LDH a GLDH. V záložke. 4.2 ukazuje uvedené enzýmy a ich intracelulárnu distribúciu.

V diferenciálnej diagnóze ochorenia pečene je rozšírený spôsob porovnávania stupňa zvýšenia aktivity enzýmov s rôznou lokalizáciou v hepatocyte a odrážajúcich rôzne strany funkčnej aktivity bunkových lézií. Najpoužívanejší pomer enzýmov je uvedený v tabuľke. 4.3.

Tabuľka 4.2. Pečeňové enzýmy

Tabuľka 4.3. Pomer pečeňových enzýmov

Pri ochoreniach pečene použite koeficient De Ritis (pomer aktivity AST / ALT). Pomer AST / ALT vyšší ako 2 je typický pre lézie vyvolané alkoholom a menej ako 1 pre vírusovú hepatitídu a cholestatický syndróm. Vo väčšine prípadov vírusovej hepatitídy zostal pomer AST / ALT nižší ako 1. Pri vírusovej hepatitíde sa aktivita ALT zvyšuje desaťnásobne. V akútnej alkoholickej hepatitíde je aktivita AST vyššia ako ALT, zatiaľ čo aktivita oboch enzýmov nepresahuje 500-600 IU / L. Pacienti s toxickou hepatitídou, infekčnou mononukleózou, intrahepatickou cholestázou, cirhózou, pečeňovými metastázami, aktivitou myokardiálneho infarktu AST sú vyššie ako aktivita ALT. Aktivita ALT a AST sa zvyšuje pri užívaní erytromycínu, kyseliny para-aminosalicylovej, diabetickej ketoacidózy, psoriázy, tiež sa používa na včasnú diagnostiku anikterickej hepatitídy.

V diferenciálnej diagnostike pečeňovej patológie je dôležité skúmať pomery aktivity izoenzýmov LDH. Zvýšenie relatívnej aktivity izoenzýmu LDH₅ charakteristika lézií hepatocytov. LDH hyperfermentémia je pozorovaná v rôznej miere pri akútnej vírusovej, liekovej a hypoxickej hepatitíde, zlyhaní srdca, cirhóze pečene a extrahepatickej cholestáze, ako aj poklese osmotickej rezistencie erytrocytov a hemolýze. Dlhodobé zvýšenie aktivity izoenzýmov LDH₅ a LDH₄ naznačuje prítomnosť pečeňových metastáz.

V súčasnosti je v diagnostike ochorení pečene stabilita koloidných systémov stále hodnotená tymolom a sublimatickými testami. Patologické výsledky odrážajú počiatočné obdobia akútnej hepatitídy, toxického poškodenia pečene, exacerbácie chronickej hepatitídy. Proteíny ESP v krvnom sére tiež poskytujú nešpecifické údaje, ale umožňujú posúdiť povahu patologického procesu. Percento albumínu, proteínov akútnej fázy a y-globulínov pomáha pri diagnostike patológie pečene: nízky albumín a vysoké hladiny y-globulínov sú charakteristické pre cirhózu pečene. Zvýšená hladina y-globulínov v krvi sa tiež nachádza v tukovej infiltrácii pečene, zápale žlčových ciest a malignite.

Obsah albumínu v sére má diagnostickú hodnotu pri akútnych a chronických formách hepatitídy. Vo všetkých prípadoch akútnej hepatitídy zostáva hladina albumínu v krvi normálna.

Chronická hepatitída je sprevádzaná hypoalbuminémiou a hypergamaglobulinémiou.

Pečeň je ústredným článkom v regulácii zrážania krvi. Hepatocyty syntetizujú fibrinogén, mnohé aktivátory a inhibítory kaskády enzymatických reakcií. Akútna aj chronická hepatitída narušujú túto reguláciu. Diagnostické testy ochorenia pečene zahŕňajú predĺženie protrombínového času, akumuláciu produktov deštrukcie fibrinogénu v krvi. Akútne poškodenie pečene je sprevádzané zvýšeným krvácaním v podmienkach hypofibrinogenémie.

Porucha funkcie pečene je sprevádzaná zmenami metabolizmu LP. Hypertriglyceridémia je charakteristická pre rôzne formy patológie pečene. Hypercholesterolémia sa často vyskytuje pri blokovaní žlčových ciest a obštrukčnej žltačke. Pri chronickej hepatitíde sa voľný cholesterol akumuluje v krvi v dôsledku poklesu jeho esterifikácie v krvnom obehu. Za podmienok výraznej cholestázy je pozorovaná tvorba cholestatických makroskopických foriem LP-LP-X, ktoré tvoria komplex LP s fragmentom plazmatickej membrány.

Vo väčšine prípadov ochorenia pečene zostáva etiologický faktor nad rámec diagnózy a klinické biochemici tvoria diagnózu založenú na princípoch syndrómovej diagnózy.

Hlavnými patologickými procesmi, ktoré tvoria laboratórnu diagnózu ochorenia, sú nasledujúce syndrómy:

• intrahepatická a extrahepatická cholestáza;

• toxické lézie hepatocytov;

• nedostatočnosť syntetických procesov v hepatocytoch;

• spomalenie inaktivácie toxických zlúčenín;

Syndróm cytolýzy. Patofyziologický základ syndrómu cytolýzy je porušením integrity plazmatickej membrány hepatocytov a ich organel s rozvojom hyperfermentémie. Ťažká hyperfermentémia, keď cytozolické enzýmy vstupujú do krvného obehu, je charakteristická pre infekčnú hepatitídu, medicínske a toxické poškodenie pečene, otravu, dekompenzovanú cirhózu a perifokálny zápal parenchýmu pri cholangitíde. V enzymatickej diagnostike cytolýzneho syndrómu dominuje definícia

Aktivity ALT, AST a LDH. Normálne aktivita ALT a AST v krvi nepresahuje 24 IU / l; do 100 IU / L sa hyperfermentémia považuje za „sivú zónu“, ktorá môže byť spôsobená reaktívnymi zmenami v hepatocytoch. Aktivita ALT nad 100 IU / l indikuje poškodenie parenchýmu pečene. Zvýšenie aktivity ALT v 100-200 krát (až na 2-6 tisíc IU / l) odráža rozsiahle poškodenie hepatocytov pri vírusovej hepatitíde a otrave organickými rozpúšťadlami.

Syndróm intrahepatickej a extrahepatickej cholestázy. Intrahepatický cholestázový syndróm určuje porušenie odtoku žlče z pečene. Zvýšenie objemu hepatocytov vedie ku kompresii žlčových ciest, zhoršenej drenážnej funkcii. Príčinou veľkých pečeňových kanálikov je extrahepatická cholestáza; najvýraznejšia cholestáza s obštrukčnou žltačkou. V záložke. 4.4 ukazuje kombináciu laboratórnych testov najčastejšie používaných na diferenciálnu diagnostiku cholestázy.

Tabuľka 4.4. Diagnóza cholestázy

Spoľahlivé markery intrahepatického cholestázového syndrómu sú zvýšenie aktivity ALP, GGT a 5-nukleotidázy v krvi. V epiteliálnej membráne žlčového kanála sa enzýmy nachádzajú blízko pri sebe, takže pri deštrukcii membrán sa ich aktivita v krvnom obehu zvyšuje súčasne a rovnako.

Reaktívne zmeny epitelu žlčových ciest a plazmatických membrán hepatocytov sa hodnotia na základe aktivity alkalickej fosfatázy. Aktivita alkalickej fosfatázy pomáha pri diferenciálnej diagnostike intrahepatickej a extrahepatickej cholestázy. Počas extrahepatickej obštrukcie (kamene žlčových ciest, novotvar papily Vater) sa alkalická aktivita fosforu zvyšuje 10-násobne alebo viac. Intrahepatická obštrukcia parenchymálnych lézií (hepatitída) je sprevádzaná

je zvýšenie aktivity alkalickej fosfatázy o 2-3 krát Akútna nekróza hepatocytov nemusí byť sprevádzaná zvýšením aktivity alkalickej fosfatázy, ak nespôsobuje kompresiu žlčových ciest (intrahepatická cholestáza). Nie všetky patologické procesy v pečeni pozorujú závislosť medzi aktivitou alkalickej fosfatázy a hyperbilirubinémiou. V počiatočných štádiách intrahepatickej cholestázy je zvýšenie aktivity alkalickej fosfatázy dôsledkom aktivácie jej syntézy; ďalšie zvýšenie je spojené so zničením žlčových kanálikov pôsobením žlčových kyselín.

Syndróm intracelulárnej cholestázy. Zvýšenie veľkosti hepatocytov a ich kompresia žlčových ciest medzi segmentmi pečene vedie k výskytu intracelulárneho cholestázového syndrómu s miernym zvýšením aktivity alkalickej fosfatázy a GGT v krvi a poškodením epitelu žlčových ciest. Zvýšenie krvného obsahu žlčových kyselín je tiež včasným príznakom cholestázy.

Častým príznakom ochorenia pečene sprevádzaného cholestázou je akumulácia bilirubínu v krvi. Závažnosť hyperbilirubinémie je pre diferenciálnu diagnostiku intrahepatickej a extrahepatickej cholestázy nespoľahlivá. Hyperbilirubinémia má prognostickú hodnotu. Zvýšenie hladiny bilirubínu je päťnásobne typické pre intrahepatickú cholestázu, zvýšenie koncentrácie bilirubínu je 10-krát viac charakteristické pre akútnu hepatitídu.

Syndróm toxického poškodenia hepatocytov sa vyvíja napríklad pri intoxikácii alkoholom, keď účinky cytolýzy chýbajú, ale alkohol porušuje funkciu mitochondrií.

Pri akútnej intoxikácii alkoholom sa vyvíja syndróm toxického poškodenia subcelulárnych formácií a neporušuje sa integrita plazmatických membrán v hepatocytoch. Alkoholové metabolity majú toxický účinok, najmä acetaldehyd, ktorý vzniká priamo v mitochondriách. Súčasne je v bunke narušená tvorba vysokoenergetických zlúčenín, najmä ATP, ktorá má patologický účinok na detoxikačné procesy toxických zlúčenín. V akútnom období alkoholickej hepatitídy môže dominovať aktivita AST v krvi v dôsledku vysokej aktivity mitochondriálneho izoenzýmu AST, nie cytoplazmy.

Zapojenie hepatocytov do patologického procesu mitochondrií je sprevádzané výskytom aktivity GlDG v krvi. Zvýšená aktivita GlDG je skorý alkoholický hepatitídový test, ale 8 až 10-násobné zvýšenie aktivity GlDG s miernou aktiváciou AST a ALT je charakteristické pre obštrukčnú žltačku. Pre toxické látky

Účinky alkoholu sú charakterizované výrazným zvýšením aktivity GGT v krvi bez významného zvýšenia aktivity alkalického fosforu.

Syndrómová nedostatočnosť syntetických procesov sa prejavuje znížením syntézy hepatocytových transportných proteínov, proteínov systému zrážania krvi, CE.

HE a jeho izoenzýmy syntetizujú hepatocyty. V podmienkach parenchymálnej lézie sa znižuje syntéza ChE a jej aktivita v krvi. Častejšie dochádza k poklesu krvného tlaku v dôsledku toxických účinkov (cytostatiká, insekticídy, fungicídy, fluoridy). Fyziologický pokles aktivity ChE sa vyskytuje počas tehotenstva. Zaznamenali sa zriedkavé prípady geneticky určeného poklesu syntézy ChE.

Pri akútnom zlyhaní pečene sa u každého 4. pacienta vyvíja hypoglykémia. Za podmienok akumulácie intermediárnych metabolitov a vývoja inzulínovej rezistencie je možný aj výskyt hyperglykémie. Pri dlhodobom zlyhaní pečene dochádza k hyperinzulinémii (zníženie deštrukcie hormónu v pečeni). Za podmienok hypoxie a aktivácie anaeróbnej glykolýzy vzniká metabolická acidóza s akumuláciou kyseliny mliečnej v krvi (laktátová acidóza). Metabolická acidóza vedie k porušeniu pomeru elektrolytov. Porážka parenchýmu pečene je sprevádzaná znížením tvorby kreatinínu a močoviny. K tomu prispieva prirodzene nedostatočný príjem bielkovín a poruchy trávenia. Hlavnou príčinou hypokreatininémie je však zníženie syntézy kreatinínu v hepatocytoch. U pacientov s hepatitídou je hypokreatininémia spojená so znížením hladiny kyseliny močovej v krvi.

Syndróm spomaľovania inaktivácie toxických zlúčenín je spôsobený inhibíciou ich hydroxylácie v mikrozomálnom aparáte hepatocytov, čo znižuje rýchlosť inaktivácie v tele mnohých liekov. Za týchto podmienok môže aj nízka terapeutická dávka liečiva spôsobiť výrazný vedľajší účinok.

Pečeň slúži ako biologická bariéra endogénnych a exogénnych toxických zlúčenín, ktoré pochádzajú predovšetkým z gastrointestinálneho traktu. Hodnotenie detoxikačnej funkcie pečene sa častejšie vykonáva s chronickými léziami s použitím stresových testov s galaktózou, kyselinou fenoltetrabromftalénsulfónovou, bromocyanovym greenom, značenými zlúčeninami. Záťažové testy poskytujú možnosť diagnostikovať chronické formy ochorenia, hodnotiť ich

reziduálne účinky prenesenej hepatitídy, tvoriť predstavu o funkcii pečene v cirhóze, mastnej infiltrácii pečene.

V ťažkých situáciách hepatálnej kómy s akútnou vírusovou hepatitídou alebo portálnou hypertenziou sa hodnotí detoxikačná funkcia pečene na základe množstva amoniaku v krvi. Tvorba amoniaku v črevách prebieha neustále v dôsledku vitálnej aktivity mikroorganizmov a deaminácie aminokyselín vytvorených z potravinových proteínov. Uprostred masívneho krvácania zo žalúdka alebo žíl pažeráka dochádza k zvýšenej tvorbe amoniaku z krvného albumínu.

Zápalový syndróm je spôsobený aktiváciou buniek RES. Vyznačuje sa zvýšením krvného obsahu proteínov akútnej fázy, dysproteinémiou v rozpore s pomerom sérových proteínov na elektroforegrame, zmenou vzoriek sedimentov (tymol), zvýšením koncentrácie imunoglobulínov.

Napriek rôznorodosti týchto porúch je použitie syndromických diagnostických metód účinné už v raných štádiách ochorenia pečene. Samozrejme, výsledky biochemických štúdií v diagnostickom procese nie sú jedinečné. Klinickí lekári zároveň využívajú údaje z anamnézy a fyzikálneho vyšetrenia, výsledky radionuklidovej diagnostiky, počítačovej tomografie a biopsie pečene. Diferenciálna diagnostika v počiatočných štádiách ochorenia a hodnotenie povahy poškodenia hepatocytmi sa môže vykonať len na základe laboratórnych testov, najmä údajov z klinickej biochémie. Použité kombinácie laboratórnych štúdií sú uvedené v tabuľke. 4.5.

Tabuľka 4.5. Diagnostika ochorení pečene enzýmami

4.3. PATOLÓGIA KOSOVEJ TISKY

Medzi hlavné faktory regulujúce metabolizmus fosfátov a vápnika patria PTH, kalcitonín a vitamín D. PTH a kalcitonín si zachovávajú konštantnosť vápnika v cievnom lôžku a extracelulárnej tekutine, ovplyvňujú absorpciu vápnika v čreve, reabsorpciu v obličkách, črevách a ukladanie v kostnom tkanive. PTH reguluje vápnik v krvi, ovplyvňuje absorpciu vápnika v čreve a renálnych tubuloch, mobilizáciu vápnika z kostného tkaniva. Kalcitonín má menej významný účinok, znižuje aktivitu osteoklastov, zvyšuje aktivitu osteoblastov, čo vedie k poklesu vápnika v krvi.

PTH je polypeptid, ktorého jediný reťazec pozostáva z 84 aminokyselinových zvyškov. Hormon vylučuje príštitné telieska, pravdepodobne vo forme inaktívneho prekurzora, z ktorého je aktívny hormón vytvorený štiepením polypeptidového fragmentu. Aktívny PTH má krátky polčas, čo spôsobuje problémy pri analýze: použitím rádioimunoanalýzy sa meria hlavne karboxyterminálny fragment hormónu, ktorý má dlhší polčas, ale je biologicky neaktívny.

Pri pôsobení na obličky PTH potláča reabsorpciu fosforu v proximálnych a distálnych tubuloch nefrónu, zvyšuje jeho vylučovanie a tým znižuje hladinu fosforu v krvi (hypofosfatémia). Zároveň hormón zvyšuje reabsorpciu tubulárneho vápnika, najmä v distálnych tubuloch nefrónu. Pôsobenie PTH v kostnom tkanive spôsobuje mobilizáciu vápnika a fosfátu, čo prispieva k výskytu osteoporózy a hyperkalcémie. Negatívna spätná hypokalcémia je hlavným stimulom pre sekréciu PTH, zatiaľ čo hyperkalcémia potláča tvorbu hormónu prištítnych teliesok. PTH tiež zvyšuje absorpciu vápnika a fosforu v čreve, stimulujúc syntézu 1,25-dihydroxycholekalciferolu.

V prípadoch hypersekrécie PTH s paratyroidným adenómom sa vyvíja výrazná osteoporóza s prítomnosťou t

hyperkalcémia a hypofosfatémia a zvýšené vylučovanie vápnika a fosfátov v moči. Za týchto podmienok je inhibovaná reabsorpcia fosfátov v tubuloch a následne je zvýšené jej vylučovanie, klírens fosfátov je zvýšený s výskytom hyperkalcémie v podmienkach kostnej resorpcie s rozvojom osteoporózy. Diagnózu môžete potvrdiť stanovením koncentrácie PTH v krvi. V prípadoch, keď je hypofosfatémia sprevádzaná hyperkalcémiou, je diagnosticky dôležité aj mierne zvýšenie obsahu hormónov.

Treba mať na pamäti, že v niektorých formách nádorov pľúc, obličiek, vaječníkov sa v nádorových bunkách vyskytuje ektopická tvorba PTH. Medzi týmito stavmi je potrebné rozlišovať formu krivice rezistentnej na vitamín D. Toto zriedkavo sa vyskytujúce dedičné ochorenie spojené so sexom sa nazýva Fanconiho syndróm. Táto látka sa vyznačuje vysokým vylučovaním fosforu v moči súčasne s glukozúrií a aminoacidúriou bez výskytu acidózy v krvi.

Pri chronickom zlyhaní obličiek môže nastať aktivácia syntézy PTH ako kompenzačného mechanizmu pri rozvoji hypokalcémie a hyperfosfatémie. Sekundárny hyperparatyreoidizmus sa tiež pozoruje pri osteomalacii, spôsobenej významným znížením absorpcie vápnika v čreve so zvýšeným vylučovaním.

Tento patologický stav sa najčastejšie vyvíja ako komplikácia chirurgického zákroku na štítnej žľaze, keď sa omylom odstránia príštitné telieska. V tomto prípade je hladina vápnika v krvi tak nízka, že sa vyvíjajú špecifické príznaky hypokalcémie a hyperfosfatémie (príznaky Khvostek a Trusso), vylučovanie vápnika a fosforu močom sa znižuje. Tento stav vyžaduje okamžité intravenózne podanie chloridu vápenatého.

V klinickom obraze pseudo-hypoparatyroidizmu je zmena hladín fosfátov a vápnika v krvi podobná ako pri primárnom hypoparatyroidizme, ale zároveň sa zvyšuje obsah PTH v krvi. Tento stav

charakteristické pre genetické ochorenie (Albrightova choroba) spojené s neschopnosťou renálnych tubulárnych buniek reagovať na hormón.

Druhý hormón, ktorý reguluje metabolizmus fosforu a vápnika, je kalcitonín. Jednoreťazcový peptid s 32 aminokyselinovými zvyškami vylučuje parafolikulárne bunky laterálnych lalokov štítnej žľazy. Tento hormón inhibuje mobilizáciu fosfátov a vápnika, zatiaľ čo ich obsah v krvi sa znižuje (hypokalcémia a hypofosfatémia). Účinok hormónu na obličky nie je dobre známy; kalcitonín sa odporúča na zvýšenie tubulárnej exkrécie fosfátov. Okrem toho hormón inhibuje stimulačný účinok PTH na syntézu 1,25-dihydroxyhaloalkalciferolu.

ÚLOHA VITAMÍNU D

Tretím faktorom, ktorý aktívne ovplyvňuje metabolizmus vápnika a fosforu v kostnom tkanive je vitamín D. Syntéza vitamínu D v tele prebieha v dvoch stupňoch hydroxylácie: prvá sa vyskytuje v pečeni za vzniku látky s obmedzenou biologickou aktivitou; druhá fáza sa vyskytuje v obličkách s tvorbou vitamínu D₃, cholekalciferol s maximálnou biologickou aktivitou. Vitamín D v tenkom čreve₃ stimuluje absorpciu fosforu a vápnika, v proximálnych častiach tubulárnej časti nefrónu aktivuje reabsorpciu oboch iónov. Faktory, ktoré aktivujú syntézu vitamínu D₃ v obličkách je zníženie obsahu fosforu v krvi a účinok PTH.

V podmienkach nedostatku vitamínu D, v dôsledku zníženia obsahu jeho prekurzorov rozpustných v tukoch v potravinách, nedostatočného ultrafialového žiarenia kože alebo malabsorpcie, sa v krvi pozorovala výrazná hypofosfatémia. V reakcii na zvýšenie sekrécie PTH, absorpciu vápnika a fosfátov v tenkom čreve a mobilizáciu minerálov z nárastu kostného tkaniva. Po určitom čase to normalizuje obsah vápnika v krvi, ale koncentrácia fosforu môže zostať znížená v dôsledku inhibície jeho reabsorpcie parathormónom.

Pri chronickom zlyhaní obličiek sa vyvíja syndróm renálnej osteodystrofie - komplexné porušenie metabolizmu kostného tkaniva a homeostázy fosforu a vápnika. Zníženie glomerulárnych hodnôt

filtrácia produkuje hyperfosfatémiu, vyvíja sa hypokalcémia s poklesom syntézy vitamínu D v obličkách a rezistencia na jeho účinky. Hyperfosfatémia môže prispievať k rozvoju hypokalcémie v dôsledku poklesu absorpcie vápnika v tenkom čreve v dôsledku tvorby nerozpustných apatitov.

CHOROBY TABUĽKY METABOLICKEJ KOSTY

Vlastné metabolické ochorenia kostí sú rozdelené na osteoporózu, osteomaláciu, osteodystrofiu, osteogenézu imperfecta a osteoporózu. Choroby kostí sa môžu vyvíjať aj na pozadí inej patológie, ako je akromegália alebo ektopická kalcifikácia vo vaskulárnej stene (s aterosklerózou a normálne s tvorbou "mozgového piesku" v epifýze).

Osteoporóza je najčastejším metabolickým ochorením kostí. Osteoporóza je typická pre mnohé ochorenia, charakterizované generalizovanou stratou kostného tkaniva, ktorá prevyšuje vekové a pohlavné štandardy a vedie k zníženiu sily kostí, čo spôsobuje náchylnosť na zlomeniny (spontánne alebo s minimálnym poškodením). Osteoporóza sa má odlišovať od osteopénie (atrofia kostného tkaniva súvisiaca s vekom) a osteomalacie (zhoršená mineralizácia kostnej matrix).

Rizikové faktory pre osteoporózu zahŕňajú kaukazskú alebo mongolskú rasu, predispozíciu rodiny, telesnú hmotnosť nižšiu ako 58 kg, fajčenie a alkoholizmus, nízku alebo nadmernú fyzickú aktivitu, skorú menopauzu, neskorý nástup menštruácie, amenoreu a neplodnosť, predĺženú laktáciu (viac ako 6 mesiacov). viac ako tri tehotenstvá a pôrod v reprodukčnom veku, ako aj zneužívanie kávy (viac ako päť šálok denne), nedostatok príjmu vápnika z potravy a dlhodobá parenterálna výživa.

Klinický obraz sa vo väčšine prípadov vyvíja postupne, zvyčajne počas niekoľkých rokov. V laboratórnej diagnostike je dôležité stanoviť hladinu alkalickej fosfatázy (môže sa prechodne zvýšiť po zlomeninách), vápnika a fosfátov (zvyčajne normálne). Aktivita kostnej resorpcie je určená pomerom hladiny vápnika v moči k hladine kreatinínu v moči a pomeru obsahu hydroxyprolínu v moči ku hladine kreatinínu v moči. Röntgenové vyšetrenie chrbtice odhaľuje pokles hustoty kostí s akcentáciou

kortikálne kontúry. Vzhľad týchto odchýlok na rádiografe je možný len so stratou aspoň 30% kostného tkaniva.

Osteomalacia je kostná patológia, ktorá sa vyskytuje, keď organická matrica kostí nie je dostatočne mineralizovaná. U detí ide o krivicu (pozri nižšie) u dospelých, metabolické poruchy vápnika, fosforu a vitamínu D.

Rachitída - ochorenie v ranom detstve, ktoré je dôsledkom nedostatku vitamínu D, charakterizované zmenami kostného tkaniva s vývojom skeletálnych deformít. Všetky patofyziologické procesy sú spôsobené hypokalcémiou v dôsledku nedostatku vitamínu D a jeho metabolitov. Kompenzačná aktivácia prištítnych teliesok a hyperprodukcia PTH, ktorá mobilizuje vylučovanie vápnika z kostí a zvyšuje absorpciu vápenatých a fosfátových solí v čreve. Vyskytujú sa hypofosfatémia, metabolická acidóza a poruchy osteogenézy.

Deformujúca osteodystrofia (deformácia osteitídy, Pagetova choroba) je dedičné ochorenie charakterizované deformáciou femorálnych a tibiálnych kostí, chrbtice a lebky s ťažkou hyperostózou, zahusťovaním a zakrivením kostí, zvýšeným výskytom nádorov. Zvyčajne sa vyskytuje vo veku nad 50 rokov. Klinický obraz je zvyčajne asymptomatický, najčastejším prejavom je bolesť kostí alebo kĺbov. Zriedkavejšie sú zaznamenané deformity kostí, bolesti hlavy, patologické zlomeniny, zvýšenie telesnej teploty nad postihnutou končatinou, srdcové zlyhanie s vysokým srdcovým výstupom a rôzne neurologické poruchy spôsobené kompresiou nervového tkaniva (s poškodením lebky, z ktorých najčastejšie sú hluchoty). Laboratórnou charakteristikou je zvýšenie alkalického fosforu a osteokalcínu v osteosclerotickej fáze, zvýšenie hladiny hydroxyprolínu v osteolytickej fáze. Sérový vápnik a fosfor sú zvyčajne normálne.

Renálna alebo uremická osteodystrofia je časté poškodenie kostí podobné osteomalácii, krivicii alebo fibróznej osteitíde; pri chronickom zlyhaní obličiek.

Albrightova dedičná osteodystrofia je spôsobená odolnosťou cieľových buniek voči účinku PTH (pseudohypoparathyroidizmu). Pacienti s pseudohypoparathyroidizmom sú rezistentní voči iným hormónom pôsobiacim cez systém adenylátcyklázy.

(hormón stimulujúci štítnu žľazu, glukagón, FSH, LH). U týchto pacientov sa pozoruje charakteristický fenotyp, ktorý sa prejavuje brachydakticky, krátkym vzrastom, subkutánnou osifikáciou. Albrightova choroba je často kombinovaná s diabetes mellitus, arteriálnou hypertenziou, obezitou, menštruačnými poruchami (oligomenorea), arteritídou, polyartrózou. Tiež charakterizované mentálnou retardáciou a kŕčmi (v dôsledku hypokalcémie).

Nedokonalá osteosyntéza je dedičné ochorenie, ktoré spôsobuje pokles kostnej hmoty (v dôsledku porušenia osteogenézy) a spôsobuje ich zvýšenú krehkosť; často sprevádzané modrým sfarbením skléry, anomáliami zubov (nedokonalá dentinogenéza) a progresívnou stratou sluchu. Ultrazvuk odhaľuje ťažké formy plodu od 16. týždňa tehotenstva. Diagnóza je možná pomocou štúdií DNA vo vzorkách biopsie choriových klkov. Symptomatická a ortopedická liečba.

Osteoporóza a osteoskleróza sú kolektívne a v praxi identické koncepty charakterizujúce relatívne zvýšenie obsahu kostného tkaniva v kostiach, čo vedie k zníženiu objemu dutín kostnej drene s nevyhnutným poškodením hemopoézy.

Mramorová choroba. Sú známe viaceré dedičné formy: dominantná dedičná choroba Albers-Schoenberg a recesívne formy sú malígne, benígne a letálne formy. Frekvenčný všetky formy - približne 1: 20.000 Klinicky osteopetrózy v tejto patológie sa prejavuje niekoľko zlomenín, osteomyelitídu, hyperostózy lebku, chronickej nádchy kvôli zúženie nosových priechodov, hepatosplenomegália (spôsobené vyrovnávacia extramedulárne krvotvorby), lícneho nervu obrnou, anémia (spôsobený poklesom objemu kostnej drene) a laboratórne - zvýšením hladiny alkalickej fosfatázy.

4.4. ZNAČKY RASTU MALIGNANTU

Niet pochýb o tom, že úspech liečby rakoviny sa dá očakávať len vtedy, keď sú malígne nádory zistené v ranom štádiu vývoja, avšak otázka včasného odhalenia príznakov takýchto patológií je stále otvorená.

Diagnostické schopnosti klinických onkológov sa v posledných rokoch výrazne rozšírili v súvislosti s používaním moderných inštrumentálnych diagnostických metód: angiopatiou a lymfografiou, diagnostikou rádionuklidov, počítačom.

termografické a röntgenové tomografy, rádio-magnetická rezonancia, ultrazvuk s Dopplerovým efektom, ktorý umožňuje získať farebný obraz nádoru a posúdiť vlastnosti mikrocirkulácie. Moderné imunomorfologické a cytologické štúdie umožňujú štúdium bioptických vzoriek nielen samotného nádoru, ale aj rôznych sekrétov (spúta, moč, ascitická tekutina). V súčasnosti je komplexná laboratórna biochemická a imunologická diagnostika založená na identifikácii nádorových markerov, hormónov, biologicky aktívnych zlúčenín, izoforiem enzýmov, ako aj metabolitov kostnej prestavby v prípade metastatických kostných lézií.

Začiatok štúdie nádorových markerov bol veľmi povzbudzujúci. Už koncom 19. storočia sa v moči pacientov s mnohopočetným myelómom našli špecifické proteíny (imunoglobulíny), ktoré sa nazývali Bens-Jonesove proteíny, ale ďalší úspech musel čakať viac ako 80 rokov. Je to spojené s objavom GI. Abelev a Yu.S. Tatarín α-fetoproteín v krvi pacientov s hepatómom. Tieto štúdie znamenali začiatok nového štádia v štúdii faktorov spojených s rastom malígnych nádorov av dvadsiatom storočí viedli k objaveniu série rôznych zlúčenín nazývaných „nádorové markery“. Markery sú široko používané klinickými biochemikmi na identifikáciu primárneho nádoru a jeho metastáz. Medzi markery malígneho rastu patria látky rôznej povahy. Tieto zahŕňajú viac ako 200 zlúčenín: antigény, hormóny, enzýmy, glykoproteíny, lipidy, proteíny, metabolity, ktorých koncentrácia koreluje s hmotou nádoru, jeho proliferatívnou aktivitou a v niektorých prípadoch so stupňom malignity novotvaru. Abnormálna expresia genómu je jedným z hlavných mechanizmov produkcie markerov nádorovými bunkami, ktorý určuje syntézu embryonálnych, placentárnych a ektopických proteínov, enzýmov, antigénov a hormónov.

Ako ideálny test pre včasnú diagnózu malígnych nádorov bolo navrhnutých mnoho markerov, ale doteraz nebolo nájdené žiadne riešenie. Ťažkosti spôsobené rôznorodosťou požiadaviek na ideálny marker. Ideálny nádorový marker by mal produkovať nádorová bunka v dostatočných množstvách tak, aby sa mohol stanoviť pomocou moderných metód. Nemala by byť prítomná u zdravých ľudí av benígnych nádoroch,

marker by mal byť detegovaný v skorých štádiách nádorového procesu, počet nádorových markerov by mal byť priamo úmerný objemu nádoru, tento marker by mal byť stanovený pred klinickými prejavmi nádoru, hladina ideálneho markeru by mala korelovať s výsledkami protinádorovej liečby.

V klinických štúdiách sa používa množstvo dostatočne účinných nádorových markerov, ktoré však nie vždy úplne spĺňajú všetky vyššie uvedené kritériá. Moderné biochemické a imunologické metódy môžu odhaliť tumory, keď podmienený počet nádorových buniek dosiahne 109 až 1010 a minimálna hladina markera vylučovaného nádorom je od jedného do niekoľkých femtomolov (všetky údaje sú založené na 1 ml krvného séra). Vysoká účinnosť použitia nádorových markerov na klinike sa môže dosiahnuť kombináciou rôznych testov. Treba poznamenať, že počet navrhovaných markerov na diagnostiku a monitorovanie malígnych nádorov sa neustále zvyšuje a nastáva fáza kritického prehodnotenia s cieľom vytvoriť stratégiu a adekvátne použitie.

4.4.1. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV TESTOVANIA ZNAČIEK TUMOROV

Stanovenie koncentrácie nádorových markerov v rôznych neoplazmoch vyžaduje znalosť faktorov in vivo a in vitro, ktoré ovplyvňujú výsledky alebo ich skresľujú. Toto by sa malo rovnako zohľadniť nielen u laboratórnych lekárov, ale aj u lekárov, ktorí sú priamo zodpovední za proces pozorovania a liečby konkrétneho pacienta. Nasledujúce faktory sú hlavné faktory ovplyvňujúce definíciu nádorových markerov.

• stupeň expresie a syntézy markera;

• uvoľňovanie markerov nádorovými bunkami;

• lieky a chemoterapeutiká;

• vylučovanie z tela;

• intenzita prívodu krvi do nádoru;

• Poloha tela pacienta počas odberu krvi;

• inštrumentálne a iné ako inštrumentálne vyšetrovacie metódy (napríklad bronchoskopia alebo biopsia);

• katabolizmus nádorového markera (napríklad funkčný stav pečene a obličiek);

• zlé návyky (fajčenie, pitie alkoholu). In vitro:

• podmienky skladovania vzoriek;

• časový interval medzi odberom krvi a centrifugáciou (so separáciou séra);

• stupeň hemolýzy a žltnutia;

• kontakt ciev na odber krvi s kožou;

• kontaminácia vzorky slinami;

• vplyv liekov;

• prítomnosť protilátok proti myším imunoglobulínom v krvi pacientov (po diagnostickej imunosupresii a imunoterapii);

• metodická chyba pri stanovení nádorového markera. Je potrebné vziať do úvahy, že väčšina obehu

markery krvných nádorov sú nevhodné na skríning pacientov v neprítomnosti symptómov, pretože existuje množstvo obmedzení spojených s často nízkou diagnostickou senzitivitou a špecificitou, ako aj obmedzenou prediktívnou hodnotou. Súčasne existuje množstvo uznaných prípadov, keď je ťažké riadiť sa bez definície nádorových markerov.

V prvom rade ide o hodnotenie účinnosti liečby. V počiatočných štádiách môžu zmeny koncentrácie nádorového markera ukázať, či vybraná chemoterapia bude úspešná, alebo (v prípade trvalého zvýšenia koncentrácie) je potrebná korekcia liečby až po zrušenie. Testovanie nádorového markera je v prípade závažných prípadov rakoviny úplne zbytočné.

Po druhé, monitorovanie priebehu ochorenia. Použitie nádorových markerov na monitorovanie priebehu neoplázie často umožňuje detegovať metastázy a / alebo recidívu nádoru po dobu 3-5 mesiacov alebo viac pred klinickými prejavmi ochorenia. U niektorých pacientov môže testovanie nádorových markerov po chirurgickom odstránení miesta primárneho nádoru poskytnúť citlivejšie monitorovanie ako endoskopia, ultrasonografia alebo počítačová tomografia. Miera zvýšenia hladiny nádoru

marker vám zvyčajne umožňuje urobiť záver o množstve pozorovaní

0 charakter progresie ochorenia, najmä o metastázach. Znalosť povahy zmien v úrovni nádorového markera tiež umožňuje optimalizovať čas následného podrobného vyšetrenia pacienta. Zatiaľ čo sa udržiava nízka alebo normálna hladina nádorového markera počas dostatočne dlhého času, následné vyšetrenie, vrátane invazívnych alebo drahých techník, sa zdá byť nadbytočné. Naopak, ak sa zvýši hladina nádorových markerov a pri rozhodovaní o liečebnej taktike sú potrebné informácie o progresii ochorenia, takéto štúdie sú ukázané.

Po tretie, identifikácia zvyškových a rekurentných nádorov. Nedostatočné slabé zníženie hladiny nádorového markera alebo absencia poklesu všeobecne indikuje neúplné odstránenie nádoru alebo prítomnosť viacerých nádorov (metastáz). Informácie tohto druhu môžu mať terapeutický a prognostický význam.

A nakoniec, po štvrté, predpovedanie priebehu nádorového procesu. Ide o mimoriadne intenzívne sa rozvíjajúce moderné pole aplikácie nádorových markerov, najmä tých, ktorých výskum súvisí s prognózou, a teda primárne ovplyvňuje výber terapie.

4.4.2. COLORECTAL CANCER

V európskych krajinách ochorie kolorektálny karcinóm (CRC)

1 z 20 ľudí. Menej často sa tento typ rakoviny nachádza v Afrike a častiach Ázie. Teraz v Rusku, miera detekcie CRC monotónne zvyšuje.

V súčasnosti sa použitie molekulárnych metód v diagnostike CRC považuje za veľmi sľubnú a dôležitú oblasť výskumu, čo je spôsobené skutočnosťou, že udalosti vyskytujúce sa na úrovni genómu by sa mali považovať za kľúčové pri výskyte a progresii týchto nádorov. Existuje množstvo spoľahlivých skutočností, ktoré naznačujú, že CRC v počiatočných štádiách vývoja môže a musí byť identifikovaný molekulárnymi metódami. Metódy molekulárnej diagnostiky CRC vám tiež umožňujú predpísať adekvátnu liečbu a presne predpovedať výsledok.

CRC sa vyvíja v dôsledku následných zmien (dysplázia / adenóm-adenokarcinóm), ktoré sú založené na genetickej t

porušovanie. Mechanizmy zodpovedné za výskyt a akumuláciu takýchto porúch v epitelovej bunke však nie sú úplne známe. Príkladom ťažkostí pri štúdiu tohto problému je skutočnosť, že existujú rozdiely vo frekvencii výskytu benígnych a malígnych fáz ochorenia, a to v sekvencii dysplázie / adenokarcinómu. Bolo dokázané, že kolorektálne adenómy sa vyskytujú vo viac ako polovici populácie do 9. desaťročia života a CRC sa vyvíja len u 5% populácie. V dôsledku toho sa len niekoľko z prekanceróznych zmien transformuje na rakovinu.

Spolu so starnutím a chronickými zápalovými ochoreniami (ulcerózna kolitída, Crohnova choroba alebo postihnutie hrubého čreva schistosomiázou) je CRC u príbuzných krvi uznávaným, ak nie hlavným rizikovým faktorom. Príčiny, ktoré spôsobujú CRC u jedného člena rodiny, sa môžu líšiť od zriedkavých autozomálne dominantných syndrómov s vysokým výskytom CRC (familiárna adenomatózna polypóza, hereditárny nepolypousový CRC syndróm) k menej geneticky jasným podmienkam, ako je napríklad detekcia adenómu v najbližšom okolí. príbuzní (rodič, súrodenec alebo dieťa). Je známe, že CRC sa objavil v mladšom veku, čím vyššie je štatistické riziko jeho výskytu medzi blízkymi príbuznými. Dedičné syndrómy CRC sú uvedené v tabuľke. 4.6 podľa fenotypu a mutácií v príslušných génoch.

Je potrebné poznamenať, že štúdium molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom zriedkavých dedičných syndrómov, prispelo k pochopeniu patogenézy sporadickej CRC, ktorá sa v populácii pozoruje oveľa častejšie, ale je založená na podobných alebo podobných molekulárnych udalostiach.

Úloha molekulárno-genetických porúch vo výskyte CRC a najmä nestability genómu sa intenzívne študovala pomerne nedávno. V roku 1993 sa zistila nestabilita mikrosatelitov (MSI) u členov rodiny s dedičnou rakovinou hrubého čreva (RTC). Tento objav poslúžil ako základ pre hypotézy mutantného fenotypu rakoviny, ktorý popísal Loeb, podľa ktorého musí bunka prežiť rôzne mutácie, aby sa stala rakovinovou. Ale na to by mala mať pôvodne schopnosť mutovať častejšie ako normálne, a to zase môže

Tabuľka 4.6. Dedičné syndrómy CRC

Tabuľka 4.7. Typy genetických porúch a molekulárne markery v CRC

sú spojené s inaktiváciou mechanizmov zodpovedných za normálne uchovanie štruktúry DNA.

V takmer všetkých prípadoch RTK je zaznamenaná nestabilita chromozómov alebo nestabilita MSI. V skutočnosti existuje inverzný vzťah medzi týmito dvoma porušeniami. Malígne nádory, ktoré majú MSI nestabilitu, sú zvyčajne diploidné a nemajú chromozomálne aberácie. Nádory s chromozomálnou nestabilitou sú charakterizované aneuploidiou a sú často sprevádzané stratou alebo výskytom ďalších chromozómov. Častá detekcia chromozomálnej nestability alebo nestability MSI v tomto prípade neznamená, že ide o veľmi bežný a nešpecifický jav v procese nástupu akéhokoľvek malígneho nádoru, ale že nestabilita genómu je úzko spojená s tumorogenézou.

Chromozomálna nestabilita a nestabilita MSI môžu byť detegované vo veľmi skorých štádiách RTK. Takže pri použití komparatívnej hybridizácie genómu na stanovenie priemerného počtu chýb počas kopírovania sme boli schopní preukázať ich postupné zvyšovanie s progresiou adenómu s miernou dyspláziou na adenóm s ťažkou dyspláziou a následnou transformáciou na rakovinu (tabuľka 4.8).

Tabuľka 4.8. Chromozomálna nestabilita v prípade RTK

U pacientov s vrodenou predispozíciou v dôsledku porúch génu APC, vrátane porúch nukleotidovej sekvencie a génovej expresie, sa vyvíjajú nádory, ktoré sa zvyčajne vyvíjajú ako výsledok chromozomálnej nestability, ktorá je charakterizovaná stratou alel a cytogenetickými poruchami. U niektorých pacientov so sporadickou CRC sa nádory vyskytujú rovnakým spôsobom.

Na rozdiel od toho u pacientov s dedičným nepolipozovaným CRC syndrómom majú mutácie v DNA korigujúce chyby DNA za následok nádory charakterizované nestabilitou MSI a nukleotidy detegované ako opakované nukleotidové sekvencie, z ktorých niektoré sú umiestnené v kodónoch génov. Strata alel je zriedkavo pozorovaná. Tento typ molekulárnej patológie je tiež pozorovaný v približne 15% prípadov sporadického CRC a je často spojený s anatomickými znakmi, ako je napríklad umiestnenie v proximálnom čreve (vzostupné hrubé črevo); nízka diferenciácia nádorových buniek s hlienom, medulárnym alebo crikoidným bunkovým komponentom; prítomnosť významného počtu lymfoidných folikulov s germinálnymi centrami na okraji nádoru; infiltrácia lymfocytového nádoru.

Neefektívna transkripcia génov ako výsledok aberantnej metylácie cytozačných guanínových sekvencií (C-G ostrovy) v promótorových oblastiach génov sa v súčasnosti považuje za jednu zo zložiek molekulárnej patogenézy tretieho poddruhu CRC.

Použitie metód molekulárnej diagnostiky u pacientov má veľký potenciál tak v včasnej diagnostike, ako aj v hodnotení odpovede nádoru na liečbu, ako aj v prognóze ochorenia. Ako je uvedené v tabuľke. 4.9 s takou diagnózou môžete použiť rôzne predmety štúdia.

U tých pacientov, ktorí už majú CRC, môžu byť na identifikáciu mikrometastáz použité molekulárne metódy, aby sa presnejšie vyhodnotilo štádium nádorového procesu, najmä aby sa detegovali mikrometastázy v lymfatických uzlinách, alebo aby sa vyhodnotilo možné hematogénne šírenie nádorových buniek v kostnej dreni.

Okrem toho molekulárna diagnostika má veľký potenciál na detekciu genotypových a fenotypových charakteristík nádoru, ktoré určujú celý reťazec udalostí vedúcich k metastázovaniu buniek, tzv.

Tabuľka 4.9. Použitie metód molekulárnej diagnostiky pre CRC

genotyp a fenotyp. Markery tohto typu by mohli indikovať väčšiu pravdepodobnosť progresie nádorového procesu po radikálnej operácii.

Boli identifikované genetické abnormality spojené s predikciou alebo odpoveďou na chemoterapiu pre CRC, vrátane straty alely pri 18q, zmiznutia expresie génu DCC, abnormalít v géne p53, straty alel na krátkom ramene chromozómov 1 a 5, mutácií RAS. Štúdie klinickej účinnosti použitia takýchto molekulárnych markerov boli presvedčivo formulované, v súčasnosti prebiehajú a zahŕňajú reprezentatívnu vzorku populácie. Na široké použitie v klinickej praxi musia štúdie molekulárnych markerov spĺňať všetky požiadavky na rutinné laboratórne testy, ako je reprodukovateľnosť, dostupnosť a primeraná kontrola kvality. Výsledky štúdií molekulárnych markerov by mali klinickí lekári ľahko interpretovať a mať terapeutickú hodnotu.

Zložitosť a viacstupňové genetické a biochemické procesy vyskytujúce sa v rakovinových bunkách, ktoré im umožňujú metastázovať, sťažujú interpretáciu hodnôt takýchto markerov. Okrem toho faktory, ktoré priamo nesúvisia s nádorom, ako je napríklad kvalita chirurgickej techniky, významne ovplyvňujú konečný výsledok. Medzi nádorovými markerovými génmi, ktoré predpovedajú terapeutickú odpoveď, bola pozornosť zameraná na p53 a gény regulované apoptózou, ktoré sú regulované p53.

Jednou z oblastí molekulárnej genetickej štúdie nádorov je identifikácia molekulárnych porúch charakteristických pre neskorší vývoj metachrónnych nádorov, niekedy mylne považovaných za opakovanie hlavného nádoru. Takéto štúdie zahŕňajú štúdiu kolorektálnych adenómov ako cieľa na identifikáciu markerového génu z dôvodu ich vysokej frekvencie v populácii ako prekanceróznej zmeny v porovnaní s nízkou frekvenciou detekcie malígnych nádorov. Molekulárny marker ukazujúci vysokú pravdepodobnosť vývoja metachrónnych adenómov, najmä adenómov, schopných transformácie na malígny nádor, by mohol byť užitočný na identifikáciu rizikových skupín pre následné kolonoskopické skríning.

Naopak, pacienti, u ktorých je nepravdepodobné, že by metachrónne adenómy postupovali, môžu byť vylúčení zo skríningu. Stratégia odstraňovania adenómov ukázala, že je spojená so znížením frekvencie CRC a môžu byť užitočné molekulárne markery, ktoré identifikujú pacientov s vyšším rizikom.

Štúdia vzoriek stolice a krvi má tiež veľký potenciál. Použitie veľmi jednoduchého testu na skrytú krv vo výkaloch teda znížilo úmrtnosť na CRC, ale jeho špecifickosť zostáva relatívne nízka. Molekulárne testy na detekciu vo výkaloch fragmentov DNA nádorov sú progresívnejšie. Viaceré štúdie ukázali, že DNA obsahujúca mutácie môžu byť identifikované vo výkaloch a krvi pacientov, ktorí majú nádory s týmito mutáciami. Diagnóza nádorov, skríning a dynamické pozorovanie pacientov sa môže výrazne zlepšiť, ak sa prekonajú určité technické ťažkosti a ich náklady sú vyvážené.

V súčasnosti výskumníci venujú veľkú pozornosť štúdiu perspektív využitia molekulárno-genetických markerov CRC. Nižšie je stručná charakterizácia nádorových markerov, ktoré sa v klinickej praxi najčastejšie používajú.

Prvýkrát bol v roku 1965 objavený Gold-Freedman v štúdii ľudského gastrointestinálneho tkaniva a adenokarcinómu hrubého čreva. Neskôr sa CEA zistila v sére pacientov s CRC. Tieto prvé práce boli veľmi povzbudzujúce. Potom sa to zdalo mnohým, ktorí našli

vysoko špecifický test diagnózy RTK. Avšak neskôr, ako sa zlepšili metódy detekcie CEA a akumulácie klinických údajov, tento marker bol tiež schopný byť izolovaný v iných nádoroch (rakovina pankreasu, pečene, pľúc, štítnej žľazy a neuroblastómu), ako aj pri neoplastických ochoreniach (cirhóza pečene, ulcerózna kolitída, pankreatitída, chronická bronchitída, emfyzém, vírusová hepatitída, divertikulitída, polypy, zlyhanie obličiek). Preto nie je možné pri detekcii CEA úplne presne povedať, že pacient má tento typ rakoviny. Zároveň je CEA stále markerom prvej voľby pre CRC a používa sa s vysokou účinnosťou pri monitorovaní ochorenia, ale hlavná pozornosť sa venuje kvantitatívnym parametrom metódy.

U 99% zdravých ľudí je hladina CEA nižšia ako 5 ng / ml. S CRC sa citlivosť testu pohybuje od 25 do 80% a závisí od veľkosti a stupňa diferenciácie nádoru, ako aj od rozsahu procesu. Hladina CEA koreluje so štádiom nádorového procesu. Takže podľa súhrnných údajov rôznych autorov, v súlade so stupňami podľa Dukesovej klasifikácie, bolo zvýšenie koncentrácie typické pre antigén: v štádiu A - 7,8 ng / ml, B - 30,3 ng / ml, C - 58,1 ng / ml. ml, D - 134,3 ng / ml. Zároveň sa zvýšila frekvencia detekcie CEA (pri hraničnej hodnote markera 5 ng / ml) v skupinách pacientov s indikovanými štádiami a zodpovedala 3, 25, 45 a 65%, a pri hodnote prahovej hodnoty> 2,5 ng / ml sa zistila ešte častejšie s vyššie uvedenými hodnotami. Dukesove stupne a zodpovedali 28, 45, 75 a 84%. Vzhľadom na skutočnosť, že v štádiu A a B bol nádorový marker zvýšený len u 3-28% pacientov, jeho použitie pri včasnej diagnostike CRC je problematické. Vysoko diferencované tumory produkujú CEA aktívnejšie.

Podľa mnohých autorov má marker prognostickú hodnotu, ktorá spočíva v skutočnosti, že vysoká počiatočná hladina CEA v krvnom sére (viac ako 25 ng / ml) naznačuje vysoké riziko vzniku skorého relapsu CRC po chirurgickom odstránení nádoru.

Jedným z príkladov použitia CEA je stanovenie radikálnej povahy chirurgického zákroku v CRC. Po radikálnom chirurgickom odstránení nádoru sa spravidla do konca 6. týždňa koncentrácia antigénu dostane pod normálnu hodnotu. Ak hladina markera neklesne po odstránení primárneho nádoru,

si myslia, že pacient má metastázy. Odporúča sa stanoviť CEA u pacientov v pooperačnom období po 3 mesiacoch počas 2 rokov. Pravidelné monitorovanie pacientov s CRC so zahrnutím CEA zlepšuje 5-ročnú mieru prežitia. Adjuvantná chemoterapia (5-fluóruracil a levamisol) u pacientov s CRC môže spôsobiť prechodné zvýšenie hladiny CEA v krvnom sére. Neodporúča sa rutinne určovať CEA pri monitorovaní odpovede na liečbu, neexistujú však žiadne alternatívne testy na hodnotenie odpovede na liečbu u pacientov s CRC.

U väčšiny pacientov s RTK (79,1%) sa v porovnaní s kontrolnou skupinou (10%) zistili protilátky IgM a IgG proti CEA, čo tiež umožňuje použitie tohto indikátora ako diagnostického markera a nezávislého prognostického faktora. Súčasne je detekcia protilátok proti CEA v sére pacientov s CRC spojená s lepšou prognózou a významným zvýšením 2-ročného prežitia.

Analýza hladiny CEA v výplachu hrubého čreva pred endoskopickým rutinným vyšetrením ukázala, že tento jednoduchý test môže byť užitočný v praktickom lekárstve na identifikáciu skupín pacientov s vysokým rizikom CRC.

Použitie CEA na diagnostické účely je obmedzené jeho nízkou špecificitou v dôsledku zvýšenia koncentrácie sérového antigénu v ne-neoplastických ochoreniach, ako aj účinku určitých exogénnych a endogénnych faktorov na syntézu tohto markera. Preto pri skúmaní pacientov s nádormi hrubého čreva sa CA-19-9 používa ako marker druhej voľby (pozri nižšie). To je obzvlášť dôležité v prípade REA-negatívnych neoplaziem.

Vzhľadom na nízku citlivosť a špecifickosť sa neodporúča používať definíciu CEA pri skríningu CRC. V prípade 5-násobného zvýšenia CEA v sére a prítomnosti klinických ťažkostí u pacienta sa odporúča navrhnúť CRC.

Porovnávacia analýza troch nádorových markerov (CA-19-9, CEA a α-fetoproteín) v sére pacientov s RTK v rôznych štádiách nádorového procesu u pacientov s chronickou ulceróznou kolitídou a u zdravých ľudí odhalila významný rozdiel medzi pacientmi s lokalizovaným RTK a chronickým ochorením. ulceróznou kolitídou v zmysle CA-19-9 a CEA, ako aj medzi lokalizovanou a generalizovanou RTK pre vyššie uvedené dva

nádorové markery. Hodnoty nádorových markerov pri chronickej ulceróznej kolitíde neprekročili hodnoty normálnych hodnôt. V lokalizovanom procese hladina CA-19-9 nepresahuje 1000 jednotiek / ml, CEA - 20 ng / ml. Parametre a-fetoproteínu u pacientov s CRC sú v normálnom rozsahu a spravidla sa zvyšujú len vtedy, keď je nádorový proces zovšeobecnený, čo neumožňuje použitie tohto markera v diagnóze ochorenia. Pri použití komplexného CA-19-9 + REA je diagnostická senzitivita 91% a signifikantne vyššia ako pri použití len jedného nádorového markera. Prístup k inštrumentálnym metódam diagnostiky údajov o definícii nádorových markerov (CA-19-9 a CEA) zvyšuje frekvenciu detekcie lokalizovaného CRC o 14% a počas generalizácie procesu o 9%.

Pre nádory charakterizované nerovnováhou medzi procesmi proliferácie a apoptózy. Endotelín-1, polypeptid s 21 aminokyselinovými zvyškami, má vazokonstrikčnú a mitogénnu aktivitu a je tiež zapojený do mechanizmov regulácie apoptózy. Experiment ukázal, že endotelín-1 je faktorom prežitia a je schopný in vitro chrániť PTK bunky pred apoptózou indukovanou FasL.

Frekvencia detekcie a hladina rozpustného antigénu Fas (sFas) - inhibítor apoptózy - v sére pacientov s RTK je vyššia ako u prakticky zdravých ľudí. U pacientov s RTK s metastázami v regionálnych lymfatických uzlinách a pečeni bola tendencia k zvýšeniu obsahu sFas v sére, čo umožňuje diskutovať o úlohe systému Fas / FasL ako možného cieľa pre protinádorovú terapiu u pacientov s CRC.

Ukázalo sa, že vysoká aktivita kaspázy-3 koreluje s vysokým rizikom relapsu RTK, najmä v prípadoch jeho pravostrannej lokalizácie. Bola tiež detegovaná korelácia aktivity kaspázy-3 s CD57 + bunkami filtrujúcimi nádor.

Dôležitú úlohu v mechanizmoch regulácie apoptózy v PTK hrá bcl-2, ktorý je normálne exprimovaný bunkami lemujúcimi dno krýpt hrubého čreva. Expresia bcl-2 v B-štádiu RTK Dukes sa ukázala byť spojená s lepším prežitím pacientov, a preto u pacientov, u ktorých nádory neexprimujú bcl-2, sa odporúča uskutočniť adjuvantnú terapiu.

Expresia imunoreaktívneho p53 v primárnom nádore v CRC je markerom vysokého rizika recidívy ochorenia po chirurgickom odstránení ochorenia a častejšie po prvom roku pozorovania. Súčasne sa zistila zvýšená expresia p53 u 47 a CEA u 34,4% nádorov. Predpokladá sa, že pri hodnotení prognózy CRC je potrebné definovať oba markery.

Je známe, že genetické poškodenie rozlišuje primárne karcinómy proximálneho a distálneho hrubého čreva. Viacrozmerná analýza expresie p53 v primárnom CRC teda častejšie ukazuje zvýšenú expresiu p53 v distálnom (58,5%) ako proximálnom (41,7%) RTK. Obdobie bez relapsov je menšie u nádorov p53 + (75 a 38%; p = 0,006). Vysoké riziko recidívy CRC bolo pozorované u nádorov p53 + s ich distálnou lokalizáciou. Preto hodnotenie expresie p53 v CRC môže slúžiť ako marker skorého opätovného výskytu ochorenia a je spojené s lokalizáciou nádoru v orgáne.

Bolo dokázané, že zlyhanie chemoterapie pri CRC je spojené s multidrug rezistenciou týchto nádorov. Ukázalo sa, že expresia rôznych izoforiem CD44 je spojená s agresívnym správaním nádorov a vyvoláva otázku, či signál z tohto receptora moduluje citlivosť liečiva na nádor. Bolo tiež dokázané, že CD44 indukuje aktiváciu LYN a Akt src rodín tyrozínkináz. Schopnosť potlačiť apoptózu môže zohrávať kľúčovú úlohu vo vývoji nádorov hrubého čreva, ktorý je spojený s expresiou CD44.

Aktivátory a inhibítory plazminogénu

V posledných rokoch štúdium metaloproteináz extracelulárnej matrice, ktoré sú úzko späté s procesmi invázie a metastáz nádorov, pritiahlo pozornosť výskumníkov. S rozvojom metastáz by mal byť reťazec sekvenčných udalostí vedúcich k uvoľneniu nádorových buniek z ich pôvodného prostredia a tvorbe nádorových uzlín vo vzdialených orgánoch a tkanivách. Predpokladá sa, že na zabezpečenie procesov invázie a metastáz je potrebný komplexný proteolytický reťazec, vrátane rôznych proteáz. Predpokladá sa, že plazmín, ktorý znižuje hladinu glykoproteínov extracelulárnej matrix a aktivuje niektoré prometalloproteázy, hrá kľúčovú úlohu v procesoch invázie a metastáz, zatiaľ čo

vo viacstupňovom proteázovom reťazci je serínová proteáza kľúčovou polohou - aktivátor plazminogénu urokinázového typu (uPA), pretože katalyzuje tvorbu plazmínu z jeho prekurzorového plazminogénu. IRA receptor (Pc-uPA) tiež hrá dôležitú úlohu, pretože keď sa uPA viaže na receptor, zvyšuje sa jeho schopnosť aktivovať plazminogén. Na druhej strane, inhibítory uPA-PAI-1 a PAI-2 môžu byť prítomné v PTK tkanivách. Ukázalo sa, že hladiny uPA a PAI-1 v CRC sú vyššie ako v homológnych normálnych tkanivách a benígnych nádoroch.

Otázka, či uPA v ľudskej RTK je odvodená od rakovinových buniek samotných alebo elementov okolitého stromatu (fibroblasty, makrofágy, leukocyty), zostala po dlhú dobu nezodpovedaná. Nakoniec Harvey a kol. bolo možné dokázať, že aktivátor pochádza z rakovinových buniek samotných a nie je požičaný z elementov stromatu a antigén je najintenzívnejšie detegovaný v apikálnych a bazálnych oblastiach PTK buniek.

Najreprezentatívnejšiu štúdiu zložiek aktivačného systému plazminogénu vo vzorkách CRC uskutočnil Fujii et al. Analyzovali tiež expresiu génov uPA a PAI-1 pomocou metódy PCR. Expresia UPA bola detegovaná u 58,8% nádorov. U pacientov s pozitívnym uPA a negatívnymi výsledkami pre PAI-1 bola 5-ročná prognóza prežitia významne horšia. Multivariačná analýza ukázala, že výsledky súčasného stanovenia uPA a PAI-1 v CRC sú nezávislé prognostické ukazovatele.

Prežitie pacientov po chirurgickom zákroku nekoreluje s obsahom uPA v stróme nádoru, avšak bol zaznamenaný vzorec súvisiaci s jeho hladinou v epiteli nádoru, t.j. stanovenie hladiny uPA môže byť testom na diagnostiku RTK bez metastáz, ako aj riziko skorého relapsu. po operácii. Je možné, že proteázy môžu byť zacielené liečivami, ktoré bránia invázii a metastázam CRC.

Pečeňové metastázy sú dôležitým faktorom obmedzujúcim prognózu u pacientov s RTK. Existuje korelácia medzi iRA a pečeňovými metastázami. Transdukcia génu tPA do PTK buniek môže byť užitočná z hľadiska boja proti pečeňovým metastázam.

Najmenej študovaný v klinickom zmysle je zložka aktivačného systému plazminogénu považovaná za Rc-uPA, čo je glykopeptid viazaný na membránu viazaný na membránu. toto

receptor môže tiež existovať v rozpustnej forme (rRc-uPA) v extraktoch z nádoru, ako aj v krvnej plazme zdravých ľudí a pacientov s rakovinou. Rozpustná Rc-uPA v plazme je prakticky nezmenená molekula, ale ani presný mechanizmus jej uvoľňovania z povrchu bunky, ani jej biologická funkcia, nebol úplne študovaný. Zvýšené hladiny rRs-uPA v plazme boli detegované u pacientov s RTK a koncentrácia rRs-uPA je spojená s prognózou ochorenia. Je možné, že Pc-uPA môže významne prispieť k zvýšeniu angiogenézy okolo nádoru, ako aj k mikrovaskulárnym metastázam.

Zvýšená expresia Rc-uPA, ktorá charakterizuje invazívnu schopnosť nádoru in vitro aspoň v niektorých subpopuláciách RTK buniek, je teda čiastočne dôsledkom konštantnej aktivácie signálnej kaskády závislej od mitogénom aktivovaných proteínkináz.

Receptory rastového faktora

Jedným z dôležitých regulačných systémov pre mitogénnu signálnu transdukciu je rodina receptorov tyrozínkinázy - produktov skupiny onkogénov c-erbB, ktorá zahŕňa štyri transmembránové receptory podobnej štruktúry - receptor epidermálneho rastového faktora (EPRF alebo ErbB1), ako aj ErbB2 (HER2 / neu). ErbB3 (HER3) a ErbB4 (HER4). Okrem štruktúry sa tieto receptory líšia relatívnou špecificitou a afinitou pre rôzne bežné ligandy. Po aktivácii v dôsledku väzby ligandu a dimerizácie je aktivovaná vnútorná receptorová tyrozínkináza a získava schopnosť fosforylovať receptor samotný aj iné bunkové proteíny podieľajúce sa na prenose mitogénneho signálu.

Rôzne rastové faktory sa podieľajú na autokrinnej a parakrinnej regulácii proliferácie CRC buniek. V posledných rokoch sa klinický význam receptorov rastového faktora a ich ligandov aktívne študoval na CRC, primárne RESR, receptore rastového faktora podobného inzulínu typu 1 (RIGR-1), receptore vaskulárneho endotelového rastového faktora (R-VEGF).

REFR je onkogénový produkt c-erbB1, ktorý je transmembránovou tyrozínkinázou, ktorá je klinicky najštudovanejšou značkou tejto skupiny v nádoroch rôznej lokalizácie, ale nie je dostatočne študovaná v CRC.

Receptory ErbB rodiny môžu tvoriť homo- aj heterodiméry a v mnohých prípadoch sú najaktívnejšie heterostruktúry s účasťou druhého zástupcu tejto rodiny, HER2 / neu, ktorý nemá vlastný ligand. HER2 / neu je teda kľúčovým prvkom pri prenose mitogénnych signálov rastových faktorov podobných EGF a jeho blokovanie môže významne spomaliť alebo zastaviť rast nádorov, ktoré sú závislé od takýchto stimulov. Predpokladá sa, že zvýšená expresia HER2 / neu v nádoroch, vrátane CRC, môže slúžiť ako marker citlivosti a cieľ pre účinnejšiu bioterapiu týchto nádorov. V súčasnosti prebiehajú klinické štúdie a v literatúre sú prezentované predbežné štúdie o expresii HER2 / neu v prognóze gastrointestinálneho traktu.

RIFR-1 a RIFR-2 sú potenciálne mitogény a silné stimulátory rastu nádorových buniek. Účinky podporujúce rast oboch typov FGID sú sprostredkované, hlavne prostredníctvom FGED-1. Zatiaľ neexistuje jediný názor na klinickú hodnotu RIFR-1 v CRC.

Väčšina štúdií ukázala inverzný vzťah medzi objavom receptorov steroidných hormónov (regulácia endokrinného typu) a EGFR (auto a parakrinný typ regulácie) v nádoroch.

Blokovanie ktoréhokoľvek zo štádií prenosu mitogénneho signálu rastových faktorov môže v zásade viesť k dysregulácii proliferácie nádorových buniek a potenciálne inhibícii rastu nádoru. Experiment už skúmal dostatočne veľký počet liekov, ktoré ovplyvňujú vyššie uvedené procesy: špecifické a nešpecifické blokátory väzby EGFR na ligandy, inhibítory tyrozínkinázy a ďalšie kinázy, blokátory väzby domén SH2 efektorových proteínov s aktivovaným receptorom, zlúčeniny, ktoré potláčajú aktiváciu génu ras, vrátane inhibítorov farnezylácie. Väčšina z nich je v štádiu klinickej štúdie, hoci niektoré, najmä Herceptin, už podstúpili klinické štúdie a ukázali sa, že sú v niektorých typoch nádorov dosť účinné.

Je známe, že RTK sú cieľové tkanivá steroidných hormónov a v 25 až 60% prípadov si zachovávajú funkčnú schopnosť primárneho spojenia mechanizmu účinku jedného alebo viacerých steroidov, menovite estrogénových receptorov (RE; 40,9%), androgénov (RA; 15,5%). ), progesterón (RP; 32,6%) a glukokortikoidy (WG; 59,1%).

Ako kritérium pre priaznivú prognózu 10-ročného prežitia pacientov s CRC však možno použiť iba prítomnosť ER a RP v nádore. Re-EGs sú súčasne častejšie detegované v RTK u žien (60,5%) ako u mužov (39,5%), s lokalizovaným štádiom ochorenia (63,1%) a nádorom v pravej časti hrubého čreva (59,4%).

Nádorové markery angiogenézy

Výskumníci v posledných rokoch prejavili veľký záujem o štúdium angiogénnych faktorov v nádore a najmä VEGF. Stále rastie dôkaz, že metastázy v rôznych štádiách nádorového procesu závisia od stupňa vaskularizácie nádoru.

Pri hematogénnych metastázach musia nádorové bunky priľnúť k endotelovým bunkám, prejsť do lúmenu cievy, prežiť v cirkulujúcej krvi, zastaviť sa v špecifickom orgáne alebo tkanive a vytvoriť tam kolóniu. Vysoké angiogénne primárne nádory, vrátane CRC, s vysokou intratumorálnou vaskulárnou hustotou pravdepodobne produkujú angiogénny klon v vzdialenom orgáne, ktorý je za priaznivých podmienok schopný vytvárať metastázy. Väčšina výskumníkov sa domnieva, že vysoký stupeň nádorovej vaskularizácie je štatisticky významným markerom prítomnosti metastáz v regionálnych lymfatických uzlinách. V 77% predchádzajúcich štúdií sa zistila významná asociácia medzi angiogenézou nádoru a vývojom vzdialených metastáz. A hoci existujú významné rozdiely v študovaných skupinách pacientov a metódach používaných na hodnotenie angiogenézy, väčšina výskumníkov preukázala inverzný vzťah medzi vaskularizáciou nádoru a prežitím pacientov s CRC. Okrem toho nedostatočná vaskularizácia a v dôsledku toho aj hypoxia zvyšujú expresiu génov spojených s rezistenciou (Pg-glykoproteín, hydrofolátreduktáza) na chemoterapiu a predstavujú dôležitú neúčinnosť neoadjuvantného žiarenia a chemoterapie.

U väčšiny pacientov (73,4%) s regionálnymi metastázami v lymfatických uzlinách bolo obdobie bez relapsov významne vyššie v neprítomnosti expresie VEGF a nízkom indexe SPF (S-fáza) v nádore. Okrem prognostického významu VEGF sa ukázalo, že blokovanie VEGF receptora-2 inhibuje rast metastáz CRC v pečeni.

V súčasnosti má viac ako 200 zlúčenín angiogénnu aktivitu a všetky z nich môžu byť rozdelené do dvoch skupín podľa inhibičného účinku. Do prvej skupiny patria zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú prenos angiogénnych signálov endotelovými bunkami (antagonisty endotelových rastových faktorov, inhibítory produkcie angiogénnych faktorov, migrácia endotelových buniek) a druhé zlúčeniny, ktoré ovplyvňujú proliferáciu endotelových buniek. Najsľubnejšie antiangiogénne lieky ako marimastat, batimastat - inhibítory matrixových metaloproteináz, SU 6661.

Treba poznamenať, že v posledných rokoch sa naše znalosti o biologických procesoch, ktoré sa podieľajú na tvorbe nových mikrociev v nádore, významne zvýšili. A hoci sa ešte stále vytvárajú prognostické a terapeutické princípy, pokroky v chápaní patofyziologických mechanizmov neoangiogenézy v nádoroch sa už zavádzajú do klinickej praxe.

Hladina tymidylátsyntetázy v nádore je považovaná za jeden z najúčinnejších markerov rezistencie na liečivo a prognózu CRC. Enzým je nevyhnutný pre syntézu DNA a katalyzuje metyláciu monofosfátu deoxyuridínu na monofosfát deoxytymidínu ako kofaktora pre 5,10-metyléntetrahydrofolát (5,10-CH2FH4). Je známe, že 5-fluóruracil (5-FU), jeden z najrozšírenejších antimetabolitov pri liečbe gastrointestinálnych nádorov, keď sa podáva pacientovi, tvorí 5-fluór-2'-deoxyuridín-5'-monofosfátové formy, ktoré sa kovalentne viažu na timidylatsyntázu, čím blokujú Proces syntézy DNA v nádore. Štúdia expresných indikátorov tymidylátsyntetázy v nádoroch pacientov s CRC umožnila považovať túto kategóriu pacientov za nezávislý prognostický faktor. Súčasne bolo 10-ročné prežitie signifikantne nižšie u pacientov, u ktorých bola detegovaná nádorová expresia enzýmu.

Na základe retrospektívnej multivariačnej analýzy a vysokého stupňa spoľahlivosti výsledkov, podľa definície, v expresii tymidylátsyntázy v nádoroch, tento marker môže byť použitý na klinike ako nezávislý prediktívny faktor pre lokálnu recidívu, vzdialené metastázy, obdobie bez relapsu a celkové prežitie pacientov s RTK.

Najlepšia prognóza bola u pacientov s TRK s nízkou expresiou tymidylátsyntetázy v primárnom nádore. Výskumníci zároveň presvedčivo preukázali, že žiadne iné prognostické faktory, vrátane veku, pohlavia, stupňa diferenciácie nádoru, expresie p53, nemožno považovať za nezávislé markery prognózy, najmä opätovného výskytu tohto ochorenia.

Hladina expresie tymidylátsyntetázy v prípade generalizovaného alebo rekurentného CRC môže byť markerom citlivosti nádoru na 5-FU. Najčastejšie boli najvyššie hladiny expresie enzýmu nájdené v abdominálnych metastázach CRC (82%) v porovnaní s metastázami nádoru v pečeni (47%). Predpokladá sa, že by sa to malo brať do úvahy pri predpovedaní citlivosti diseminovaných foriem nádoru na 5-FU a individuálnej zmene chemoterapeutickej stratégie u pacientov.

Ukázalo sa tiež, že expresia tymidylátsyntetázy a tymidínfosforylázy v nádoroch neliečených pacientov s CRC má nielen prognostickú hodnotu pri voľbe 5-FU chemoterapie spolu s takými markermi proliferácie, ako sú p53 a Ki-67, ale tiež koreluje s indikátormi celkového prežívania bez ochorenia a celkového prežívania. Súčasne sa študovala aktivita týchto dvoch enzýmov biochemickou metódou v čerstvo zmrazených nádorových vzorkách a ich expresia sa porovnala použitím imunohistochemickej metódy v parafínových rezoch spolu s p53 a Ki-67. Bola tiež zistená významná korelácia medzi indexom enzymatickej aktivity tymidínfosforylázy a väzbovou aktivitou 5-fluór-2'-deoxysyridín-5'-monofosfátu (5-FU metabolitu). Bolo známe, že aktivita tymidylátsyntetázy a tymidínfosforylázy úzko súvisí s procesmi angiogenézy a proliferácie v CRC. Expresia VEGF súčasne významne korelovala s aktivitou tymidínfosforylázy a indexom Ki-67 v nádore, ako aj trvaním obdobia bez relapsu.

Pri skúmaní dihydropyrimidíndehydrogenázy, prvého enzýmu, ktorý metabolizuje 5-FU na 5-fluórdihydrouracil, sa zistilo, že expresný index tohto enzýmu v nádore sa môže použiť ako marker pri hodnotení citlivosti CRC na 5-FU.

Vysoká aktivita syntetázy oxidu dusnatého môže slúžiť ako marker agresívnejšieho toku CRC.

Navrhuje sa použitie vysoko citlivej a špecifickej metódy na stanovenie aktivity telomerázy v epiteliálnom tkanive

CRC bunky cirkulujúce v krvi. Aktivita enzýmu bola detegovaná u 72% nádorov v štádiách C a D (klasifikácia Dukes) CRC. Predpokladá sa, že tento marker v tejto minimálne invazívnej metóde môže byť použitý pri včasnej diagnostike, prognóze a monitorovaní pacientov s TCR.

Zistilo sa, že zvýšená expresia CDC25B fosfatázy v CRC bunkách v 43% prípadov indikuje zlú prognózu ochorenia. Títo pacienti preto potrebujú adjuvantnú liečbu. Predpokladá sa, že CDC25B môže slúžiť ako nezávislý prognostický marker a dokonca aj kontrolné faktory, ako sú metastázy v regionálnych lymfatických uzlinách, priemer primárneho nádoru, stupeň jeho diferenciácie a hĺbka invázie. Okrem toho úroveň expresie CDC25B silne indikuje možnú skorú rekurenciu štádií CRC B a C podľa Dukes.

Nedávno sa objavili štúdie, ktoré poukazujú na možnosť použitia enzýmu na syntézu prostaglandínov a eikozanoidov - cyklooxygenázy-2 (COX-2), známej aj ako prostaglandín endoperoxidová syntetáza, ako markera včasnej diagnostiky a prognózy CRC. Experimentálne a klinické údaje naznačujú dôležitú úlohu COX-2 v patogenéze CRC. Neprítomnosť COX-2 v epiteli normálnej mukóznej membrány a expresia proteínu u 40% polypov a 80-90% malígnych nádorov hrubého čreva sú ukázané, čo potvrdzuje účasť COX-2 v neoplastických procesoch a v progresii CRC. Bola stanovená pozitívna korelácia medzi expresiou COX-2 a veľkosťou, štádiom nádoru podľa Dukesovej klasifikácie. Zvýšená expresia COX-2 v RTC sa stala základom pre pokusy použiť jej inhibítory, najmä nesteroidné protizápalové liečivá, ako profylaktické činidlá, ktoré zabraňujú rozvoju CRC a malignancii polypov hrubého čreva. V pokusoch na zvieratách sa ukázalo, že inhibítory COX-2 majú ochranný účinok pri kolorektálnej karcinogenéze. Okrem toho tieto lieky zabránili vzniku nových polypov a prispeli k regresii existujúcich v hrubom čreve. Na druhej strane údaje z niektorých experimentálnych štúdií naznačujú, že protinádorový účinok nesteroidných protizápalových liekov je tiež spôsobený tým, že indukujú apoptózu v PTK bunkách a inhibujú angiogenézu v experimentálnych nádoroch.

Ostatné markery CRC

Stručne povedané, zameriame sa na niektoré nádorové markery, ktorých použitie je sľubné pre CRC.

Hladina expresie MUC1 v nádoroch sa môže použiť ako marker pri hodnotení progresie a prognózy CRC.

Cyklín-dependentný inhibítor kinázy P27 (KIP1) sa môže použiť ako marker na detekciu skorých štádií CRC. Nemôže sa však použiť ako marker včasnej progresie týchto nádorov.

Nedávno bolo tiež navrhnuté použitie nového markera TA90-IC, ktorý je prítomný v sére vo forme cirkulujúcich imunitných komplexov pri odhade prevalencie RTK. Základom štúdie bola skutočnosť, že podľa mnohých autorov bola hladina CEA zvýšená len u 70% pacientov v bežnom štádiu ochorenia. Vzdialené metastázy sa zistili u 86% vyšetrených pacientov, hoci mnohí z týchto pacientov klinicky mali lokalizovaný nádor bez príznakov generalizácie nádorového procesu. Analýza hladiny vyššie uvedených markerov ukázala, že koncentrácia TA90-IC bola zvýšená v 82,9% a CEA - len u 70,2% pacientov. Kombinácia oboch markerov nám umožnila stanoviť prevalenciu nádorového procesu v 93,5% prípadov. Vedci sa domnievajú, že táto práca musí pokračovať a dokázať úlohu TA90-IC pri skríningu a monitorovaní progresie CRC.

Treba poznamenať, že z klinického hľadiska môže byť najvhodnejšie súčasné stanovenie len malého počtu komplementárnych ukazovateľov, ktoré môžu charakterizovať proliferačnú aktivitu CRC, jeho metastatický potenciál, citlivosť na rôzne typy centrálnej a lokálnej regulácie. Úlohou výskumných pracovníkov v tejto oblasti je vybrať optimálnu kvantitatívne a kvalitatívne kombináciu molekulárnych markerov v diagnostike, monitorovaní a prognóze CRC.

4.4.3. CHOROBY CHOROBY Pankreasu, žalúdka, pažeráka a pečene

V západnej Európe je rakovina pankreasu zistená približne v 10 prípadoch na 100 tisíc. Asi 90% všetkých nádorov.

ochorenia pankreasu sú adenokarcinómy kanálikov a iba 5% sú neuroendokrinné neoplazmy a acinárny karcinóm.

Najrozšírenejším markerom pri diagnostike rakoviny pankreasu je CA 19-9. Špecifickosť jeho stanovenia sa pohybuje od 76 do 99% a citlivosť od 69 do 93%. Zvýšená koncentrácia CA 19-9 v sére však nie je špecifická len pre pankreatické adenokarcinómy. Vysoká hladina CA 19-9 sa zistila pri iných ochoreniach gastrointestinálneho traktu (akútna a chronická pankreatitída, cirhóza pečene, zápal žlčových ciest).

Ukázalo sa, že iba 55% pacientov s rakovinou pankreasu s priemerom nádoru menším ako 3 cm má zvýšenú hladinu CA 19-9 (> 37 U / ml). V dôsledku toho je použitie markera CA 19-9 v diagnóze rakoviny pankreasu, najmä jeho skorých foriem, obmedzené, pretože jeho hladina stúpa dokonca aj s vyššie uvedenými benígnymi procesmi v pečeni a pankrease. Odporúča sa určiť ukazovatele CA 19-9 na odhad prognózy rakoviny pankreasu, ale nie na rutinnú prax.

V perspektívnych štúdiách sa tiež študovalo množstvo ďalších markerov pre rakovinu pankreasu: CA50, CA242, CA195, muciny DU-PAN 2, CAM 17.1 / WGA. V súčasnosti by sa však CA 19-9 mala považovať za „zlatý štandard“ pri diagnostike rakoviny pankreasu.

Rakovina žalúdka je jednou z najbežnejších foriem nádoru na svete. V západnej Európe sa jej frekvencia v poslednom desaťročí znížila, zatiaľ čo v Ázii sa miera úmrtnosti zvýšila na 100 000. V USA zomiera na rakovinu žalúdka 6 pacientov na 100 tisíc ľudí.

Tri markery sú študované dostatočne podrobne pre rakovinu žalúdka: CEA, CA 19-9 a CA 72-4, ale CA 72-4 je považovaný za najcitlivejší a špecifický. CEA a CA 19-9 majú rovnakú špecificitu, hoci CA 19-9 môže byť citlivejšia ako CEA, avšak žiadny z vyššie uvedených markerov sa nemôže použiť pri skríningu a včasnej diagnostike rakoviny žalúdka.

Výskyt rakoviny pažeráka sa značne líši. V strednej Ázii je teda ich výskyt 50-100 prípadov na 100 000, zatiaľ čo v Európe a USA - 2-3 prípady na 100 tis. U 90% karcinómu pažeráka je to karcinóm šupinatých buniek a menej ako 10% adenokarcinómu.

V porovnaní s inými gastrointestinálnymi nádormi neboli biochemické markery rakoviny pažeráka dostatočne študované. Predpokladá sa však, že SCC a cytokeratíny (CYFRA 21-1, TPA, TPS) by sa mali považovať za najlepšie markery v diagnóze rakoviny pažeráka zo skvamózneho epitelu, zatiaľ čo CA 19-9 je uprednostňovaný pri diagnostike adenokarcinómov pažeráka. Avšak nádorové markery v diagnóze nádorov pažeráka dostali malú pozornosť vzhľadom na ich nešpecifickosť.

Ďalší názov tohto ochorenia je „malígny hepatóm“. Takáto diagnóza sa uskutočňuje v západnej Európe s frekvenciou 5-10 prípadov na 100 tisíc av južnej Európe menej ako 5 prípadov na 100 tisíc. Rakovina pečene sa najčastejšie vyskytuje v Číne, kde sa odporúča populačný skríning endemického zamerania tohto nádoru, aby sa zistili nádory.,

Hlavným markerom pri diagnostike hepatocelulárneho karcinómu je a-fetoproteín, ktorý pri skríningu odhaľuje nádory malej veľkosti, čo prispieva k zvýšeniu pooperačného prežitia v tejto kategórii pacientov. Treba však poznamenať, že úloha a-FP pri skríningu hepatocelulárneho adenokarcinómu nebola stanovená prospektívnymi randomizovanými štúdiami. Vzhľadom na veľmi zriedkavé zistenie týchto nádorov v západnej Európe sa predpokladá, že skríning hepatocelulárneho karcinómu nie je potrebný. Od roku 1986 sa však odporúča ultrasonografia pečene každých 6 mesiacov a stanovenie koncentrácie α-AF u pacientov pozitívnych na povrchový antigén hepatitídy B, ako aj pacientov trpiacich chronickou aktívnou hepatitídou alebo cirhózou pečene, každé 3 mesiace. Predpokladá sa tiež, že pacienti s perzistujúcou infekciou, najmä pacienti s vírusovou hepatitídou C, by mali byť tiež považovaní za ohrozených hepatocelulárnym adenokarcinómom. Je dokázané, že riziko vzniku tohto nádoru u vírusovej hepatitídy C a cirhózy pečene je 100-krát vyššie ako u neinfikovaných ľudí.

Jedným z dôležitých problémov pri použití a-FP v diferenciálnej diagnostike hepatocelulárneho adenokarcinómu sú hepatitída a cirhóza pečene, pri ktorých sa tiež zvyšuje hladina nádorového markera. Preto separácia fukozylovaného a-OP z normálneho a-OP väzbou na lektíny pomáha pri diferenciálnej diagnostike vyššie uvedených ochorení. Identifikácia týchto frakcií α-OP pomáha pri diferenciálnej diagnostike hepatocelulárneho karcinómu. Okrem toho sa pri benígnych ochoreniach môže dočasne zvýšiť hladina a-FP, zatiaľ čo pri hepatocelulárnom karcinóme sa tento hladina neustále zvyšuje v krvnom sére. Stanovenie α-OP niekoľkokrát v období 2–3 týždňov preto umožňuje vylúčiť jeho falošne pozitívne hodnoty. Okrem toho sa nedávno objavil nový marker v diagnóze hepatocelulárneho adenokarcinómu - des-gama-karboprotrombínu (DCP), tiež známeho ako PIVKA II (proteín indukovaný nedostatkom vitamínu K). Kombinácia tohto markera s a-FP umožňuje identifikovať hepatocelulárny karcinóm v 86% a solitárny nádor v 78,3% av týchto prípadoch bude jeden z týchto markerov pozitívny.

4.4.4. NEFORMÁCIE ŽIVOTNÉHO REPRODUKČNÉHO SYSTÉMU

Novotvary genitálií u žien predstavujú 15% všetkých nádorov a sú rozdelené podľa rýchlosti ich rozpadu v nasledujúcom poradí: rakovina tela maternice, vaječníkov a krčka maternice. Avšak v štruktúre úmrtnosti je rakovina vaječníkov na prvom mieste, nasledovaná rakovinou krčka maternice a maternice. Napríklad v USA sa ročne registruje 20 tisíc nových prípadov rakoviny vaječníkov a 12 tisíc úmrtí z tohto nádoru. Etiológia ochorenia nie je známa, avšak za rizikové faktory sa považujú anovulácia, použitie určitých antikoncepcií, ako aj rodinná citlivosť.

Viac ako 90% ovariálnych nádorov má epiteliálny charakter, t.j. vznikajú z epitelu teloméru. Epiteliálne ovariálne tumory sú klasifikované na základe typu buniek: serózny, mucinózny, endometriioidný, číry bunkový, zmiešaný epiteliálny, nediferencovaný, skvamózny. Najčastejšie sa rakovina vaječníkov vyvíja zo seróznych buniek.

Najlepší marker epiteliálneho karcinómu vaječníkov je mucin - CA 125. Počas menštruácie sa hladina markeru u žien môže zvýšiť na 100 kU / l a vyššia. Hladina CA 125 stúpa takmer u 80% pacientov s epitelovými ovariálnymi nádormi, avšak len polovica pacientov s karcinómom vaječníkov v I. štádiu podľa medzinárodnej klasifikácie (FIGO) tohto ochorenia vykazuje vysoké miery nádorového markera. Nedostatočná citlivosť pri včasnej diagnostike, ako aj detekcia zvýšených hodnôt CA 125 u rôznych benígnych nádorov a iných adenokarcinómov neumožňujú použitie tohto indikátora ako markera na včasnú detekciu rakoviny vaječníkov. Spolu s hladinou iných markerov (a-OP, hCG, hCGb) sa môže hladina CA 125 zvýšiť s nádormi z buniek zárodočných buniek.

Prognóza rakoviny vaječníkov závisí hlavne od štádia ochorenia. Skríning CA 125 je necitlivý a iba 50% pacientov so štádiom I ochorenia má zvýšenú hladinu markera, čo je dôvod, prečo sa tento marker neodporúča na detekciu sporadických prípadov ochorenia. Určenie CA 125 v kombinácii s manuálnym rektovaginálnym vyšetrením panvových orgánov a transvaginálnou ultrasonografiou však môže byť dôležité pri včasnom odhalení rakoviny vaječníkov.

Multicentrická prospektívna štúdia postmenopauzálnych žien s nádormi v malej panve a porovnanie transvaginálnej ultrasonografie, manuálneho vyšetrenia panvových orgánov a stanovenia CA 125 (prah CA 125 35 kU / l) ukázali, že tieto metódy boli potvrdené na 77, 76 a 74%., Okrem toho sa pomocou regresnej analýzy ukázalo, že v porovnaní s ultrasonografiou je CA 125 citlivejšia, ale diagnostická hodnota je nižšia ako v manuálnej štúdii. Nádory nie sú detegované kombináciou negatívnych výsledkov týchto troch metód. Stanovenie hladiny CA 125 pred operáciou môže lekára priviesť k možnému množstvu chirurgických prínosov.

Je známe, že tradičné prognostické faktory u pacientov s rakovinou vaječníkov sú štádium ochorenia, stupeň diferenciácie a histologický typ nádoru, veľkosť reziduálneho nádoru po paliatívnej cytoreduktívnej chirurgii. Súčasne multicentrické štúdie ukázali, že hladina CA 125 v sére pacientov po 1., 2. a 3. cykle chemoterapie je jedným z najdôležitejších prognostických faktorov skorej liečby.

relaps ochorenia. Dlhší polčas CA 125 alebo menej ako 7-násobné zníženie hladín nádorových markerov v prvých mesiacoch po liečbe naznačuje slabý výsledok. Ďalšie štúdie ukázali, že koncentrácia CA 125> 70 kU / l pred tretím priebehom chemoterapie je najdôležitejším faktorom pri predpovedaní progresie ochorenia v nasledujúcich 12 mesiacoch.

CA 125 pri monitorovaní pacientov s rakovinou vaječníkov umožňuje zistiť skorú recidívu. V literatúre však nie sú žiadne údaje o tom, že včasná detekcia recidívy ochorenia môže zlepšiť mieru prežitia. Nárast CA 125 indikuje reziduálnu chorobu v 94,8% prípadov, ale takmer polovica pacientov s normálnymi hodnotami markerov mala aj ochorenie (nádorové uzliny) podľa „druhého vzhľadu“ -parparómie. Hladiny CA 125 sa zvyšujú v sére 25% pacientov, ktorí majú len mikroskopické príznaky ochorenia a u 79% pacientov, ktorých priemer rekurentného nádoru je počas laparotómie väčší ako 1 cm.

Rakovina prsníka

Rakovina prsníka (BC) je jednou z hlavných príčin úmrtia žien v západoeurópskych krajinách a počas života ženy je riziko tohto nádoru 12,2% a riziko jeho úmrtia je 3,6%. Existuje mnoho faktorov, ktoré sú spojené s rizikom rakoviny prsníka: genetické a rodinné faktory, hormonálne (skoré menarche, neskoré menopauzy, neskoré prvé tehotenstvo) faktory, diéta, benígne ochorenia prsníka (hlavne spojené s atypickou hyperpláziou).

V súčasnosti je pre rakovinu prsníka známych mnoho nádorových markerov: MIS-1 (CA 15-3), CEA, onkoproteíny, cytokeratíny. Najpoužívanejšie sú CEA a CA 15-3. Existujú aj iní členovia rodiny MIS-1 génov: MSA, CA 519, BR27-29, BRMA. Všetky majú približne rovnakú citlivosť a špecifickosť, ako aj SA 15-3. Preto použitie niekoľkých markerov nepridáva okamžite k informáciám získaným pomocou CA 15-3. V súčasnosti sa intenzívne študuje rad markerov, ako sú cytokeratíny (TPA, TPS, CYFRA 21-1) a rozpustné onkoproteíny (c-erbB-2), ktoré sa podrobujú klinickému hodnoteniu.

Citlivosť nádorových markerov u pacientov s včasným karcinómom prsníka je veľmi nízka (15-35%), takže ich použitie v diagnostike

často ťažké. Výsledné nízke hodnoty markerov samozrejme nevylučujú prítomnosť primárnych a metastatických ohnísk. Na druhej strane vysoké hladiny markera u pacientov s rakovinou prsníka takmer úplne indikujú prítomnosť generalizácie nádoru a jednotlivých metastáz.

Vysoké hladiny CEA, CA 15-3 a ďalších markerov rodiny MIS-1 sú jasne spojené so štádiom rakoviny prsníka, veľkosťou nádoru a zapojením regionálnych lymfatických uzlín do nádorového procesu. Zatiaľ však nie je jasné, či sú tieto markery nezávislé prognostické faktory. Okrem toho nie je známe, či použitie takého nádorového markera ako indikátora skorého návratu ochorenia povedie k zvýšeniu prežitia bez relapsu a celkového prežitia pacienta.

V prípade radikálnej liečby karcinómu prsníka možno v časnej diagnostike relapsu preukázať aj sériové stanovenia CEA a CA 15-3. Tieto nádorové markery v priebehu 2-18 mesiacov (priemer 5,2 mesiaca) sa nachádzajú u 40-60% pacientov s recidivujúcim karcinómom prsníka pred pozitívnou odpoveďou podľa výsledkov klinických, inštrumentálnych a rádiologických metód (röntgen hrudníka, ultrasonografia pečene, skenovanie skeletu). Dynamické stanovenie hladín CEA a CA 15-3 sa považuje za skôr citlivý test pri včasnej diagnóze metastáz kostí a pečene a navyše znižuje frekvenciu pacientov s izotopovým skenovaním a diagnostickými postupmi rádioizotopov.

Tkanivové markery pri rakovine prsníka

Na rozdiel od klasických nádorových markerov, určených v sére, sú bunkové alebo tkanivové markery napísané priamo do nádorového tkaniva. Väčšina z nich charakterizuje určité biologické vlastnosti nádoru, špecifiká jeho správania a regulácie, napríklad hormonálnu citlivosť alebo tendenciu k invázii a metastázam. Pre niektoré molekulárne markery ešte nebola stanovená špecifická biologická funkcia. Hlavný význam týchto markerov spočíva v tom, že charakterizujú biologické vlastnosti každého špecifického nádoru a pomáhajú pri predikcii a individualizácii liekovej liečby ochorenia.

V záložke. 4.10 predstavuje biologicky významné ukazovatele, ktoré sú aktívnymi alebo potenciálnymi tkanivovými markermi rakoviny prsníka.

Tabuľka 4.10. Hlavné skupiny tkanivových / bunkových prognostických markerov pre rakovinu prsníka

Vo všeobecnom prípade môže mať definícia molekulárneho markera pri rakovine prsníka tri praktické výsledky: 1) identifikácia medzi pacientmi so skorými štádiami rizikových skupín rakoviny vyžadujúcich ďalšiu liečbu, ako aj pacientov, ktorí nepodliehajú adjuvantnej terapii; 2) stanovenie citlivosti na určité typy terapie a individualizácia schém adjuvantnej liečby pacientov so spoločným procesom; 3) vývoj nových liekov.

Receptory steroidných hormónov, predovšetkým receptory estrogénov (ER), patrili medzi prvé indikátory zahrnuté v praxi liečby indikátorov rakoviny prsníka v súvislosti s kategóriou bunkových markerov. O niečo neskôr sa okrem nich identifikovali receptory progesterónového receptora (RP).

Prítomnosť ER v primárnom nádore prsníka indikuje jeho potenciálnu citlivosť na terapeutické opatrenia zamerané na odstránenie zdroja estrogénov z tela alebo na potlačenie ich účinkov (ovariektómia, použitie antiestrogénov).

RP je zaujímavý ako molekulárny marker rakoviny prsníka, a to nielen preto, že je prvým prvkom bunkovej reakcie na progestíny, ktorý určuje citlivosť na zodpovedajúce lieky, ale tiež preto, že jeho syntéza v bunkách karcinómu prsníka je indukovaná estrogénmi. Prítomnosť RP môže teda indikovať funkčnú aktivitu ER.

V súčasnosti rôzne kliniky a laboratóriá používajú tri relatívne ekvivalentné metódy na stanovenie receptorového stavu rakoviny prsníka: rádioligand - stanovenie schopnosti viazať receptor v cytosóle nádorov; enzýmová imunoanalýza - stanovenie koncentrácie imunoreaktívneho receptorového proteínu v rovnakých cytosoloch; imunohistochemicky špecifické farbenie rezov nádorov s použitím protilátok proti receptorovým proteínom. Výhoda prvých dvoch metód je kvantitatívna, čo umožňuje objektivizovať kritériá hodnotenia stavu receptora. Rádioligandová metóda tiež umožňuje vyhodnotiť funkčnú aktivitu receptora v jednom z prvých štádií jeho interakcie s hormónom, čo robí spoľahlivosť hormonálnej citlivosti spoľahlivejšou ako pri stanovení imunoreaktívnych proteínov.

Na druhej strane, hoci imunohistochemická metóda je v semikvantitatívnom charaktere, má dôležitú zásluhu, a to, že pri zafarbovaní rezov môžete jasne

na určenie príslušnosti receptorov k nádorovým bunkám. Pri použití biochemických metód táto možnosť chýba. Okrem toho táto metóda umožňuje prácu s archívnym materiálom - parafínovými blokmi a dokonca aj hotovými okuliarmi, čo z neho robí jedinú možnú možnosť, keď potreba výskumu na receptoroch steroidných hormónov vznikla alebo bola realizovaná dlho po operácii.

Je známe, že hormonálne závislý variant karcinómu prsníka, keď je typický aspoň jeden zo receptorov steroidných hormónov, je charakterizovaný priaznivým priebehom a pooperačné obdobie u týchto pacientov je lepšie ako v prípade receptorovo negatívnych nádorov. V praktickej klinickej práci sa však výsledky stanovenia receptorov steroidných hormónov používajú hlavne pri výbere pacientov citlivých na endokrinnú terapiu.

Receptory rastového faktora. Táto skupina tiež zahŕňa samotné rastové faktory - proteíny a malé polypeptidy produkované samotnými nádorovými bunkami a ďalšie zložky nádorového tkaniva (fibroblasty, makrofágy a lymfocyty infiltrujúce nádor, endotelové bunky) a stimulujúce rast produkčných buniek (autokrinný mechanizmus) alebo susedných buniek (parakrín) mechanizmus).

Rôzne rastové faktory sa podieľajú na autokrinnej a parakrinnej regulácii proliferácie buniek rakoviny prsníka: peptidov skupiny EGF (a-transformujúci rastový faktor, amfiregulín, atď.), Ktoré interagujú so spoločným receptorom, rastovým faktorom podobným inzulínu (IGF), somatostatínom atď. Receptory týchto rastových faktorov boli u pacientov s rakovinou prsníka. Prítomnosť EGFR v nádore mliečnej žľazy, najmä v neprítomnosti receptorov steroidných hormónov, indikuje nepriaznivú prognózu ochorenia aj v skorých štádiách a rezistenciu na endokrinnú terapiu. Existujú dôkazy, že prítomnosť receptorov IGF a receptorov somatostatínu indikuje priaznivejšiu prognózu rakoviny prsníka.

Napriek tomu, vzhľadom na nejednoznačnosť výsledkov získaných rôznymi autormi, žiadny z ukazovateľov charakterizujúcich citlivosť karcinómu prsníka na auto- a parakrínové regulátory zatiaľ nevstúpil do rutinnej klinickej praxe, ako je štúdium úrovne receptorov steroidných hormónov. Dá sa však očakávať, že v blízkej budúcnosti sa záujem o štúdium EGFR u karcinómu prsníka opäť zvýši v dôsledku skutočnosti, že už v štádiu klinického t

štúdie, liečivá špecificky pôsobiace na EGFR, monoklonálne protilátky proti receptoru a inhibítory vnútornej tyrozínkinázy EGFR, ktoré boli realizované v prvom štádiu prenosu mitogénneho signálu.

Treba poznamenať, že „zlatý štandard“ v štúdii röntgenovej difrakcie sa považuje za rádioligandové stanovenie v membránovej frakcii tkanív s použitím EGF značeného125I a následnej separácie hydroxylového apatitu.

Určitý úspech v oblasti praktického použitia markerov spojených s reguláciou rastu rakoviny prsníka závislou od REFR sa dosiahol už po objavení sa liečiva Herceptin, čo je humanizovaná protilátka proti HER2 / neu, ktorá je jedným z receptorov rodiny ErbB, ku ktorej patrí REFR.

Rodina receptorov tyrozínkinázy - produkty skupiny c-erbB onkogénov, ktorá zahŕňa štyri transmembránové receptory s podobnou štruktúrou, REFR (ErbB-1), ErbB-2 (HER2 / neu), ErbB-3 (HER3) a ErbB-4 (HER4) ) je jedným z najdôležitejších regulačných systémov na prenos mitogénnych signálov.

Okrem štruktúry sa ErbB rodina receptorov líši v relatívnej špecificite a afinite pre rôzne bežné ligandy. Hlavným znakom všetkých receptorových tyrozínkináz je transmembránová lokalizácia a potreba interakcie s príslušným ligandom (aktivačným faktorom) na realizáciu kinázovej aktivity a následných biologických účinkov. Po aktivácii v dôsledku väzby ligandu a dimerizácie je aktivovaná vnútorná receptorová tyrozínkináza a získava schopnosť fosforylovať receptor samotný aj iné bunkové proteíny podieľajúce sa na prenose mitogénneho signálu. Receptory ErbB rodiny môžu tvoriť homo- aj heterodiméry a v mnohých prípadoch sú najaktívnejšie heterostruktúry s účasťou HER2 / neu receptora, ktorý nemá vlastný ligand.

HER2 / neu je teda jedinečným reprezentantom uvažovanej rodiny transmembránových tyrozínkináz, pretože bez toho, aby mal svoj vlastný ligand a neinteraguje so žiadnym zo známych rastových faktorov, ktoré aktivujú príbuzné receptory, je napriek tomu kľúčovým prvkom prenosu mitogénnych signálov všetkých EGF- podobné peptidy a je nevyhnutný pre úspešné fungovanie celého systému.

Čo sa týka prognostickej hodnoty nadmernej expresie alebo amplifikácie génu c-erbB-2, aj napriek gigantickému materiálu (viac ako 12 000 pacientov s rakovinou prsníka sa teraz skúmalo v rôznych laboratóriách po celom svete), neexistuje konsenzus o prediktívnej hodnote HER2 / neu. Niektorí autori zaznamenali jeho nepriaznivý vplyv na prežitie pacientov bez karcinómu prsníka bez metastáz v lymfatických uzlinách bez recidívy, iní výskumníci nenašli spoľahlivý vzťah medzi týmito indikátormi. Publikované údaje ukazujú, že nádory s amplifikovaným génom HER2 / neu nereagujú dobre na hormonálnu terapiu, ale sú citlivé na následnú chemoterapiu. V súčasnosti sa tiež predpokladá, že u pacientov s HER2 / neu-pozitívnymi nádormi by sa mali odporučiť intenzívnejšie režimy chemoterapie ako pacienti s nádormi, ktorí nemajú zvýšenú expresiu tohto onkogénu.

Systém aktivácie plazminogénu. Schopnosť metastázy a invázie je jednou zo základných vlastností malígnych nádorov, ktorých najdôležitejším mechanizmom je deštrukcia okolitej bazálnej membrány a extracelulárnej matrice proteázami asociovanými s nádorom. Tieto proteázy sa tiež podieľajú na neoangiogenéze, čo prispieva k proliferácii nových krvných ciev v nádore.

Proteolytická kaskáda plazmínovej aktivácie v nádorovom tkanive zaujíma centrálne miesto. Predpokladá sa, že plazmín, ktorý je schopný znížiť hladinu glykoproteínov extracelulárnej matrice a aktivovať niektoré prometálne proteázy, ako je napríklad kolagenáza typu IV, hrá kľúčovú úlohu tak v lokálnom rozšírení nádoru, ako aj v tvorbe metastáz vo vzdialených orgánoch a tkanivách. Vo viacstupňovom reťazci proteáz vedúcich k deštrukcii extracelulárnej matrice zaujíma kľúčový význam aktivátor uroginázového typu plazminogénu (uPA). UPA receptor umiestnený na povrchu bunky tiež hrá dôležitú úlohu, pretože schopnosť uPA aktivovať plazminogén sa zvyšuje, keď sa naň viaže. Všeobecne je proces tvorby plazmínu cyklická amplifikácia regulovaná mechanizmom spätnej väzby.

Okrem aktivácie uPA je do aktivácie plazminogénu zapojený aj aktivátor tkanivového typu (tPA), ale jeho úloha vo vývoji nádorov sa zdá byť opačná a znižuje deštrukciu nádorových buniek.

a ochranu okolitých tkanív. Aktivita IRA a tPA je inhibovaná dvoma proteínovými inhibítormi, ktoré patria do rodiny serpin, PAI-1 a PAI-2. Na základe experimentálnych a klinických údajov, počas rastu nádoru, hrajú odlišnú úlohu aj dva inhibítory aktivátorov plazminogénu: PAI-1 chráni nádorové bunky pred autodeštrukciou a PAI-2 inhibuje proteolytické procesy v extracelulárnej matrici.

Rôzne zložky aktivačného systému plazminogénu v tkanive prsníka môžu byť umiestnené ako na samotných nádorových bunkách, tak na fibroblastoch stromatu, lymfocytoch a makrofágoch a endotelových bunkách infiltrujúcich nádor. V tomto ohľade môžeme predpokladať, že aktivačný proces plazminogénu je primárne parakrín.

Hladina a pomer expresie zložiek aktivačného systému plazminogénu v nádorovom tkanive môže slúžiť ako indikátor metastatickej a invazívnej nádorovej aktivity, výsledkom čoho je biologicky významný prognostický faktor pre malígne nádory alebo indikátor rizika malignity pri benígnych nádoroch. Okrem toho, potlačenie aktivácie plazminogénu urokinázovým typom na rôznych úrovniach sa môže stať jedným z prístupov k vývoju nových typov antimetastatickej terapie, pre ktoré je klinické použitie nevyhnutné na identifikáciu skupín pacientov potenciálne citlivých na takúto liečbu. Vývoj takýchto liečiv sa už pomerne aktívne uskutočňuje v experimentálnych laboratóriách a farmaceutických spoločnostiach, čo robí štúdiu ich cieľových proteínov obzvlášť dôležitým výskumom na ľudských nádoroch.

Najvhodnejšou metódou na stanovenie úrovne expresie zložiek aktivačného systému plazminogénu sa v súčasnosti považuje kvantitatívny enzýmový imunotest na stanovenie ich koncentrácie v cytosóloch tkanív. Bohužiaľ, zatiaľ neboli stanovené jednotné prahové hodnoty, hoci v tomto smere sa už uskutočňuje medzinárodný výskum v oblasti spolupráce.

Vaskulárny endotelový rastový faktor. V posledných rokoch sa veľká pozornosť venovala problematike neoangiogenézy - vzniku nových krvných ciev - v zhubných nádoroch. Na rozdiel od vaskulogenézy je angiogenéza procesom rozvetvenia nových kapilárnych procesov z existujúcich krvných ciev. Skutočnosť, že nádor sa nemôže vyvíjať a rásť bez tvorby

má rozsiahlu sieť kapilár, ktoré zásobujú bunky kyslíkom a živinami. Štúdium molekulárnych mechanizmov angiogenézy umožnilo prechod od mikroskopického hodnotenia hustoty krvných ciev v nádorovom tkanive k štúdiu špecifických molekúl podieľajúcich sa na regulácii tvorby a rastu nových krvných ciev. Najdôležitejším pozitívnym regulátorom angiogenézy je nepochybne VEGF, nazývaný aj faktor vaskulárnej permeability. Jedinečnosť tohto faktora spočíva v tom, že na rozdiel od všetkých ostatných rastových faktorov je mitogénny len vo vzťahu k endotelovým bunkám. Preukázalo sa, že VEGF hrá kľúčovú úlohu v neoangiogenéze pri rakovine prsníka.

Výsledky mnohých publikovaných retrospektívnych klinických štúdií ukazujú, že expresia VEGF pri rakovine prsníka sa javí ako nevyhnutná pre prognózu ochorenia a tiež ovplyvňuje citlivosť nádorov na hormonálnu a liekovú liečbu. Ero vysoká hladina indikuje zlú prognózu pre skorú aj bežnú rakovinu prsníka. Okrem toho sa aktívne vyvíjajú a skúmajú nové liečivá s anti-angiogénnymi vlastnosťami a hodnotenie aktivity angiogenézy závislej od VEGF môže byť základom ich cieleného použitia.

Rakovina krčka maternice

Takmer na celom svete je rakovina krčka maternice po rakovine prsníka druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenia. Hlavnými rizikovými faktormi tohto ochorenia sú sociálno-ekonomické, skoré manželstvo, veľký počet sexuálnych partnerov, ako aj infekcie spôsobené ľudským papilomavírusom (HPV) (typy 16, 18, 31 a 45). Ukazovatele 5-ročného prežitia pre toto ochorenie sú asi 70%. Ak sa však novotvary zistia v počiatočnom štádiu, 5-ročná miera prežitia sa zvýši na 90%. Je potrebné poznamenať, že 90% nádorov krčka maternice je karcinóm skvamóznych buniek, iných histologických typov je to adenokarcinóm a karcinóm skvamóznych buniek. Sarkómy alebo neuroendokrinný karcinóm sú veľmi zriedkavo nájdené.

V diagnóze karcinómu skvamóznych buniek krčka maternice sa používa ako nádorový marker SCCA antigén - proteín (molekulová hmotnosť 48 kD) so silnou homológiou rodiny inhibítorov proteáz, tzv. Serpínov. Citlivosť metódy v štádiu I ochorenia je nižšia ako 30% a v štádiu IV - 90%. však

Expresia SCCA sa môže tiež zvýšiť v iných nádoroch skvamóznych buniek (rakovina pľúc, nádory hlavy a krku, rakovina pažeráka a vagíny), benígne kožné nádory (psoriáza, ekzémy), pľúca (sarkoidóza), pečeň a obličky. Tento nádorový marker sa nepoužíva pri skríningu.

Na skríning rakoviny krčka maternice sa na celom svete navrhli Papanicolauov program, inštrumentálne a morfologické diagnostické metódy, ktoré diagnostikujú preinvazívne nádory, ako napríklad karcinóm in situ (CIS) a intraepiteliálna neoplázia krčka maternice (CIN). Vývoj týchto procesov v priebehu 10-15 rokov môže predchádzať rakovine krčka maternice. V diagnostike skorých štádií sa SCCA nepoužíva, pretože hladina nádorového markera závisí od objemu primárneho nádoru, štádia a postihnutia lymfatických uzlín v procese nádoru. Zvýšené hladiny SSCA pred liečbou môžu byť nezávislým faktorom pri hodnotení metastatickej lézie regionálnych lymfatických uzlín.

Vysoké hodnoty markera pred liečbou indikujú zlú prognózu u pacientov so spinocelulárnym karcinómom krčka maternice. Niektoré štúdie ukázali, že SCCA sa môže použiť ako nezávislý prognostický faktor pri rakovine krčka maternice. V prípade adenokarcinómov krčka maternice je CA 125 užitočnejší ako prognostický faktor, ale nie SCCA.

Marker SCCA je určený na detekciu včasnej recidívy karcinómu spinocelulárnych buniek krčka maternice, ako aj na monitorovanie pred neoadjuvantnou terapiou a pred rekurentnou terapiou nádoru. V týchto prípadoch je korelácia 80%, čo má významný klinický význam pri výbere pacientov na následnú rádioterapiu alebo chirurgickú liečbu.

Rakovina endometria predstavuje 50% všetkých zhubných nádorov urogenitálneho traktu u žien a v 80% prípadov sa zistí počas vyšetrenia maternice. Prežitie v štádiu I je 80%, pri IV - 10%. V 60-80% prípadov majú nádory štruktúru adenokarcinómu.

Najčastejšie rakovina endometria zvyšuje nádorový marker CA 125: v štádiu ochorenia až do 22% a v štádiu III-IV až do 80% je hladina markera vyššia ako 35 kU / l. Neexistuje žiadny nádorový marker na skríning na včasnú detekciu karcinómu endometria. Morfologický výskum sa považuje za tradičnú metódu.

diagnostika rakoviny endometria a tkanivových vzoriek získaných po kyretáži sliznice maternice.

Pri monitorovaní karcinómu endometria sa za najlepší marker považuje CA 125. U 60% pacientov s včasnou recidívou nádoru sa zistilo, že zvýšenie séra bolo CA 125.

4.4.5. LUNG CANCER

V ekonomicky rozvinutých krajinách je mužská populácia malígnych novotvarov rakoviny pľúc v štruktúre celkovej mortality 21%. Rakovina pľúc je prototypom nádoru indukovaného chemickými karcinogénmi. Boli zistené úzke vzťahy medzi rozvojom rakoviny pľúc a fajčením cigariet, ale nie všetci fajčiari vyvinuli rakovinu, ale iba 5 - 10%, čo poukazuje na dôležitú úlohu genetickej predispozície u týchto pacientov. V takmer 50% prípadov sa môže chirurgická liečba odporúčať počas počiatočnej diagnózy, ale iba u 70% z nich je nádor resekovateľný.

Hlavnými histologickými typmi rakoviny pľúc sú: skvamózne bunky (PRL), adenokarcinóm, karcinóm veľkých buniek a rakovina pľúc malých buniek (MRL). Treba poznamenať, že MRL sa líši od iných histologických typov nádorov pľúc znakmi svojho klinického priebehu. Preto sú všetky malígne nádory pľúc rozdelené na SCLC a nemalobunkový karcinóm pľúc (NSCLC), ktoré sú súčasťou heterogénnej skupiny nádorov.

Pri rakovine pľúc sa najčastejšie študujú nasledujúce markery: neurón-špecifická enoláza (HCE), CEA, 19 cytokeratínový fragment (CYFRA 21-1), skvamózny rakovinový antigén (SCC), CA 125, tkanivový polypeptidový antigén (TPA).

Neurón-špecifická enoláza sa najprv našla v mozgových neurónoch a periférnom nervovom systéme. HSE je izoenzýmom enolázy cytoplazmatického glykolytického enzýmu (2-fosfo-D-glycerát hydroláza, EC 4.2.1.11) a pozostáva z dvoch takmer identických polypeptidových reťazcov typu y, pričom molekulová hmotnosť každej z nich je 39 000 D. V mozgu spolu s izoformou - dimér z podjednotiek typu a a hybridný izoenzým a y, ktoré majú podobnú afinitu k substráte - kyselina 2-fosfoglycerová. Enoláza obsahujúca túto podjednotku y (a-y a y-y) sa nazýva HCE. Izoformy môžu byť syntetizované gliovými mozgovými bunkami, ako aj väčšinou somatických buniek.

tkaniva. Samotný enzým sa syntetizuje v centrálnych a periférnych neurónoch a malígnych nádoroch neuroektodermálneho pôvodu (SCR, neuroblastómy, intestinálne karcinoidy).

Ukázalo sa, že horná hranica HSE u zdravých ľudí je 12,5 ng / ml. Avšak vzhľadom na to, že koncentrácie do 20 ng / ml

a viac sa môže vyskytnúť pri benígnych pľúcnych ochoreniach, pre klinickú diagnostiku je výhodná vyššia hladina prahovej hodnoty markerov (> 25 ng / ml). Zvýšenie aktivity HCE v sére bolo detegované u 40-70% primárnej

pacientov s IRL au 83 až 98% pacientov so spoločným štádiom ochorenia.

Podľa údajov poskytnutých Memorial Sloan Kettering Cancer Center (USA) frekvencia zvýšenia aktivity HCE v sére pacientov s SCR závisí od prevalencie nádorového procesu: v štádiu I-II je citlivosť testu 39%, v štádiu III-IV - 87%. Treba poznamenať, že mnohí autori v analýze diagnostického významu identifikujú relatívne vysokú špecificitu v porovnaní s inými markermi. Aktivita emfyzému sa teda zvýšila len vo výnimočných prípadoch, na rozdiel od toho sa koncentrácia CEA zvýšila v 7-36% pozorovaní. Výsledky výskumu naznačujú, že HCE je celkom použiteľný ako zvolený nádorový marker, a to tak v diferenciálnej diagnostike, ako aj v monitorovaní účinnosti liečby MRL.

Zároveň sa zistilo zvýšenie aktivity HCE v sére pacientov s tuberkulózou (27,3%), ako aj u pacientov infikovaných vírusom HIV v porovnaní s neinfikovanými. Pacienti s alveolárnymi infiltrátmi alebo intersticiálnymi foci v pľúcach mali tiež významne zvýšené hladiny HCE v sére. Predpokladá sa, že zvýšenie sérovej HSE u pacientov s benígnymi pľúcnymi ochoreniami je spojené s lokálnou hypoxiou. Uvedené výsledky by sa mali zvážiť pri analýze HCE u pacientov s rakovinou pľúc a pri obštrukčných pľúcnych procesoch.

Treba poznamenať, že vzhľadom na významnú heterogenitu rakoviny pľúc, najmä variantu malých buniek, je možné zaznamenať významný diagnostický a prognostický význam HCE v porovnaní s inými nádorovými markermi.

Do skupiny patrí aj rakovinový embryonálny antigén, reprezentovaný glykoproteínom s molekulovou hmotnosťou približne 180 kD

onkofetálne antigény, syntetizované a vylučované črevnými bunkami embrya a plodu, ako aj niektoré malígne nádory (prsník, žalúdok, rakovina pľúc). Prvýkrát sa CEA zistila u pacientov s rakovinou hrubého čreva. V súčasnosti boli zlúčeniny podobné CEA detegované aj na bunkových membránach v ne-embryonálnych a nerakovinových tkanivách. Existuje každý dôvod domnievať sa, že pečeň je hlavným metabolickým miestom CEA. Hladina CEA v krvnom sére je zvýšená u 40-80% pacientov so zhubnými novotvarmi endodermálneho pôvodu, u 20-30% u iných foriem rakoviny au 10-20% u benígnych nádorov. Najvyššia citlivosť CEA a najvyššie koncentrácie markera boli zistené u adenokarcinómu a karcinómu pľúc veľkých buniek.

Antigén zo spinocelulárneho karcinómu séra je proteín s molekulovou hmotnosťou 48 kDa, ktorý je podobný serpínom (inhibítory proteáz). Marker sa používa v diagnostike karcinómu skvamóznych buniek v rôznych orgánoch (rakovina krčka maternice, pažeráka, pľúc, nádorov hlavy a krku). Viac ako 70% pacientov s PRL má zvýšené hladiny. Avšak len v 26,1% hladiny nádorového markera sa zvyšuje v sére s adenokarcinómom pľúc a nie je detegované s SCR. U 87,8% pacientov s včasným relapsom PRL sa zaznamenala vysoká hladina SCC v sére. Identifikácia expresie SCC v imunohistochemickej štúdii pľúcnych nádorov má veľký praktický význam.

Tkanivový polypeptidový antigén je polydisperzná zmes cytokeratínov 8, 18 a 19 (molekulová hmotnosť od 20 do 45 kD), ktorá môže polymerizovať v roztoku za vzniku oligomérov. Aktivita TPA závisí od aminokyselinovej sekvencie a polohy arginínového zvyšku. Normálne sa nachádza vo vysokých koncentráciách v placente av tkanivách plodu. TPA je lokalizovaný na plazmatickej membráne a endoplazmatickom retikule nádorových buniek, je produkovaný proliferujúcimi bunkami a spontánne uvoľňovaný do prostredia. TPA sa nachádza takmer vo všetkých zhubných nádoroch.

Fragment cytokeratínu 19. Význam cytokeratínu na diferenciáciu fyziologického a patologického tkaniva je už dlho známy v histopatológii. Cytokeratíny sú nerozpustné bunkové proteíny, viac ako 20 z nich je teraz dobre charakterizovaných monoklonálnymi protilátkami. Naopak

z celej molekuly sú fragmenty cytokeratínu rozpustné v sére. V teste nádorového markera CYFRA 21-1 sa na detekciu fragmentu cytokeratínu 19 s molekulovou hmotnosťou 30 kD použili dva typy monoklonálnych protilátok (Ks 19.1 a BM 19.21). Horná hranica normálu u zdravých ľudí je 2,3 ng / ml. Test CYFRA 21-1 má dobrú špecifickosť pre benígne ochorenia pľúc, prahová hodnota je 3,3 ng / ml. Marker má vysokú citlivosť v diagnóze NSCLC.

Žiadna asociácia CYFRA 21-1 s fajčením. Ukázalo sa, že hladina CYFRA 21-1 je rovnaká v sére pacientov s malígnymi pľúcnymi ochoreniami, SCLC av kontrolnej skupine. Súčasne sa pozorovali signifikantne vyššie hladiny CYFRA 21-1 u pacientov s NSCLC, adenokarcinómom a PRL. Prezentované údaje potvrdili vysokú citlivosť a špecificitu CYFRA 21-1 v diferenciálnej diagnóze medzi malígnymi a malígnymi pľúcnymi ochoreniami, ako aj medzi MRL a NSCLC. Pacienti s metastázami v lymfatických uzlinách N2 a N3 majú najvyššiu hladinu CYFRA 21-1 v sére (5,6 ng / ml) (limity fluktuácie 3,2-11,5 ng / ml) v porovnaní s pacientmi s N0 a N1. (3,9 až 10 ng / ml) (Mann-Whitney U-test; p = 0,0373).

U všetkých typov rakoviny pľúc má CYFRA 21-1 najvyššiu citlivosť (57,7%) v porovnaní s CEA (45,3%) a SCC (22,6%). Hoci kombinácia CYFRA 21-1 a CEA pre diagnózu NSCLC, citlivosť a presnosť sú zvýšené na 75,4 a 78,1%, ale špecificita klesá na 86,5%.

Japonskí výskumníci (University of Tsukuba) navrhli, aby sa okrem cytologického vyšetrenia použili na stanovenie diagnózy a diferenciálnej diagnózy rakoviny pľúc aj stanovenie hladiny CYFRA 21-1 v pleurálnej tekutine. Je to spôsobené tým, že v pleurálnej tekutine u pacientov s karcinómom pľúc bol zistený významný nárast markera (priemerne 84,5 ng / ml) v porovnaní s pacientmi s benígnymi nádormi (13,9 ng / ml). Okrem toho sa hladina CYFRA 21-1 v pleurálnej tekutine pacientov s PRL významne líši od hladiny pneumónie, zatiaľ čo CEA takéto rozdiely neodhalila.

Pri určovaní CYFRA 21-1 je potrebné vedieť o možnom zvýšení hladiny až na 10 ng / ml v prípade progresívnych benígnych ochorení pečene a najmä v prípade zlyhania obličiek. Kontaminácia vzorky slinovými prvkami môže tiež

viesť k výraznému zvýšeniu hodnoty CYFRA 21-1. V tomto prípade výsledok nemá vplyv na pohlavie, vek, fajčenie a tehotenstvo. Štúdie všetkých typov solídnych nádorov ukázali, že CYFRA 21-1 je účinným markerom pre NSCLC a PRL.

Na záver, uvážme niektoré znaky použitia markerov malígneho rastu na klinike rakoviny pľúc na klinike.

V prvom rade by ste nemali používať všetky vyššie uvedené markery pri skríningu na asymptomatickú rakovinu pľúc alebo u pacientov s vysokým rizikom vzniku tohto typu nádoru. Primárna diagnóza a primárna liečba pacientov s rakovinou pľúc sú založené na klinických a inštrumentálnych metódach vyšetrenia (klinické, endoskopické, röntgenové vyšetrenia, intraoperačné nálezy).

Ďalej, NSE marker by mal byť považovaný za mimoriadne dôležitý v imunohistochemickej diagnostike nádorového variantu. Často len stanovenie HCE v sére pomáha potvrdiť diagnózu SCLC.

Koncentrácia SCC v sére> 2 mg / l indikuje 95% pravdepodobnosť detekcie NSCLC a 80% karcinómu dlaždicových buniek pľúc.

Pri hladinách CA 125 sa odporúča navrhnúť hladiny nad 100 U / ml a CEA nad 10 mg / l, adenokarcinóm alebo rakovinu pľúc veľkých buniek.

Nakoniec, aj keď často koncentrácia v sére CYFRA 21-1, TPA, HCE, CEA ukazuje prítomnosť nádoru, nie je pozorovaná

silný vzťah medzi produkciou nádorových markerov a histologickým variantom pľúcneho nádoru. Vo väčšine prípadov vysoká hladina v tomto prípade indikuje prevalenciu nádorového procesu, a preto by prognóza mala byť sklamaním. Nízke a priemerné hodnoty týchto markerov však nikdy nedovoľujú úplne eliminovať akýkoľvek variant nádoru alebo progresiu ochorenia.

Napriek všetkým vyššie uvedeným obmedzeniam, nádorové markery v primárnej diagnóze rakoviny pľúc môžu byť dôležité v nasledujúcich situáciách.

Po prvé, pri sledovaní u daného pacienta sa majú použiť antigény asociované s nádorom exprimované počas počiatočnej diagnózy. CYFRA 21-1, REA a CA 125 sú vysoko významné prognostické faktory pri NSCLC a HCE v MRL.

Po druhé, zníženie hladiny nádorových markerov v pooperačnom období (

2-3 dni pre CEA, 1 deň pre NSE, niekoľko hodín

pre CYFRA 21-1) poskytuje lekárovi užitočné informácie o radikálnej povahe vykonanej operácie a účinnosti liečby, a teda o dobrej prognóze. Na druhej strane pomalý pokles hladiny markera v krvnom sére indikuje nededičnosť uskutočnenej operácie a naznačuje prítomnosť reziduálnych ložísk nádoru.

Po tretie, postupné zvyšovanie nádorového markera môže byť prvým znakom relapsu ochorenia. Takéto zvýšenie možno zistiť 12 mesiacov pred klinickými príznakmi relapsu. Pri rakovine pľúc môže HCE slúžiť ako kritérium pre diferenciálnu diagnostiku rôznych histologických typov nádoru, najmä v prípadoch, keď nie je možné vykonať biopsiu a potvrdiť typ nádoru s morfologickými údajmi.

4.5. MOLEKULÁRNA GENETICKÁ DIAGNOSTIKA

Hlavnou úlohou modernej molekulárno-genetickej diagnostiky (MHD, DNA diagnostika) je detekcia dedičných anomálií pre následné použitie v diagnostike, vypracovanie prognózy a výber liečebnej stratégie pre mnohé ochorenia. Súčasne sa MHD považuje za oveľa širšiu ako len analýza sekvencie ľudskej genómovej DNA, pretože takmer vždy ďalšie informácie o dedičnom ochorení možno získať aj analýzou stavu samotných chromozómov a RNA a proteínov a metabolitov.

Podobne ako iné metódy klinickej biochémie sa genetické testovanie používa na diferenciálnu diagnostiku chorôb. Pri mnohých ochoreniach, napríklad pri dedičných formách rakoviny alebo „metabolických chybách“, sa detekcia mutácií stáva diagnostickým kritériom tak dôležitým ako klinické symptómy. Hlavnou výhodou DNA diagnostiky je však schopnosť určiť citlivosť na určité ochorenie v presymptomatickom štádiu. V niektorých prípadoch to umožňuje zabrániť rozvoju samotnej choroby chirurgickým zákrokom, liekovou terapiou alebo zmenou životného štýlu pacienta. Okrem toho prenatálne testovanie DNA dokáže detekovať dedičnosť patologických génov, a teda určiť indikácie umelého prerušenia tehotenstva.

Je potrebné poznamenať takýto sľubný smer MHD ako farmakogenetiku. Presná typizácia genotypu pacienta umožňuje vyhodnotenie génov priamo súvisiacich s absorpciou, metabolizmom a účinkom liečiva, t.j. existuje reálna príležitosť identifikovať pacientov, ktorí sú obzvlášť citliví na konkrétny liek, a vyhnúť sa komplikáciám spôsobeným intoleranciou na tento liek počas liečby. V niektorých prípadoch genotypovanie tiež umožňuje vybrať najvhodnejší liek. Už teraz sa dá povedať, že ako sa vyvíja farmakogenetika, liečba liekov sa bude vo zvýšenej miere spoliehať na analýzu genotypu pacienta.

Použitie MHD v klinickej praxi tak poskytuje dostatok príležitostí nielen na diagnostikovanie a hodnotenie genetického rizika chorôb, ale aj na výber individuálnej liekovej terapie. Predpokladá sa, že aktívny vývoj ľudskej molekulárnej genetiky dá diagnostiku DNA na rovnakú úroveň s takými nepostrádateľnými nástrojmi v arzenáli biochemického lekára, ako sú napríklad metódy na stanovenie aktivity enzýmov v krvi.

4.5.1. TYPY GENETICKÉHO REBUILDINGU

V populácii je zvyčajne niekoľko variantov (alel) každého génu. Ak je frekvencia takýchto variantov pomerne vysoká a nedá sa vysvetliť náhodným výskytom identických mutácií v rôznych rodinách, potom hovoríme o polymorfizme daného lokusu.

Vzácnejšie varianty génov sa označujú ako mutácie. Aká je hranica medzi polymorfizmom a mutáciami? Predpokladá sa, že polymorfizmus zahŕňa varianty génov, ktoré sa nachádzajú v heterozygotnej forme viac, a mutácie menšie ako v 1% populácie. V praxi sa však mutanty často nazývajú alely, ktoré predisponujú k určitej patológii, aj keď ich frekvencia v populácii je nad 1%. Nižšie sú uvedené typy mutácií, ktoré môžu viesť k patologickým zmenám.

• Najbežnejším typom mutácie sú mutácie alebo substitucia nukleotidov. Substitúcia nukleotidov v niektorých pozíciách kodónov nevedie k nahradeniu kódovanej aminokyseliny; takéto mutácie sa nazývajú tiché alebo synonymné. Keď sa kódované aminokyseliny menia v dôsledku mutácie chýb, funkcia proteínu sa často mení. Zachovanie funkcie proteínu sa pozoruje, ak

aminokyselina odvodená z mutantného kodónu patrí do rovnakej štruktúrnej triedy ako normálna aminokyselina. Jednorukleotidové substitúcie majú najväčší účinok na proteín, čo vedie k tvorbe stop kodónu (nonsense mutácií). Skrátená mRNA a proteín sú často neaktívne a rýchlo degradujú.

• Vymazania a vkladania. Takéto mutácie sa líšia v dĺžke od jedného do miliónov nukleotidov, a preto sa nazývajú mikro- a makro-delécie (inzercie). Makromutácie pochopiteľne ovplyvňujú veľmi veľké chromozómové segmenty (od 10 miliónov párov báz), t.j. je možné ich zistiť pomocou cytogenetickej analýzy. Mikromutácie ovplyvňujú malé množstvo nukleotidov a na ich nájdenie sa používajú metódy analýzy nukleotidovej sekvencie DNA. Malé inzercie a delécie nemusia ovplyvniť funkciu kódovaného proteínu. Smrteľné následky sa zvyčajne pozorujú, keď počet inzertných / delečných nukleotidov nie je násobkom troch. Keď k tomu dôjde, posun čítacieho rámca a bezvýznamná aminokyselinová sekvencia sa syntetizuje. Najčastejšie je veľmi rýchlo prerušená tvorbou nového stop kodónu. Klasickým príkladom účinku posunu rámca na účinky delécie sú dve súvisiace ochorenia - Duchenne a Beckerova svalová dystrofia. Obe sú spôsobené mutáciami v géne dystrofínu a 2/3 týchto mutácií sú v oboch delečných ochoreniach. Beckerova svalová dystrofia je omnoho miernejšia ako Duchenne, ale tento rozdiel nesúvisí s veľkosťou delécií. Dôvodom rozdielov je, že vo väčšine detegovaných prípadov Duchennovej myodystrofie vedú delécie k posunu v čítacom rámci a výsledkom je, že sa dystrofín prestáva tvoriť úplne, zatiaľ čo s Beckerovou myodystrofiou si mutantný dystrofín zachováva určitú aktivitu.

• V niektorých prípadoch mutácie ovplyvňujú nekódujúce oblasti DNA, ktoré sa podieľajú na iniciácii transkripcie daného génu alebo zostrihu mRNA. Takéto zmeny môžu tiež viesť k narušeniu štruktúry, stability alebo normálnej regulácii expresie tohto proteínu.

• Nestabilné alebo dynamické mutácie sa zvyčajne vyvíjajú v oblastiach obsahujúcich viacnásobné kópie trinukleotidových opakovaní. V dôsledku chýb replikácie DNA alebo nerovnomerného kríženia sa počet takýchto opakovaní môže zvýšiť alebo znížiť, v dôsledku čoho sa tieto mutácie nazývajú dynamické. Ak je číslo

opakovanie presahuje určitú prahovú hodnotu, funkcia daného alebo blízkeho génu je narušená. Mechanizmy vypínania génov počas akumulácie trinukleotidových opakovaní nie sú celkom jasné. Najmä pri syndróme fragilného X chromozómu zvýšenie počtu CGG opakovaní v FRAXA lokusu nad 200 vedie k metylácii a inaktivácii tohto génu. Zvýšenie počtu opakovaní trinukleotidov je tiež základom Huntingtonovej choroby (viac ako 35 CAG opakovaní v Huntingtonovom géne) a myotonickej dystrofie (viac ako 50 opakovaní v 3'-netranslatovanej oblasti DMPK génu kódujúceho proteínkinázu). Charakteristickým znakom týchto ochorení je, že v jednej rodine sa závažnosť ochorenia môže v mnohých generáciách zvýšiť v dôsledku expanzie nukleotidových opakovaní.

Vo všeobecnosti, výskyt mutácií vedie k zmene funkcie alebo expresie proteínu. Táto zmena sa prejavuje ako zvýšenie a zníženie, často až do úplnej straty, funkcie alebo expresie proteínu. V prípade zvýšenia funkčnosti je tiež možné, aby proteín získal nové funkcie.

POHYBY S FUNKCIAMI STRATY

Zníženie funkčnej aktivity proteínu v tkanive môže byť výsledkom zmeny štruktúry proteínu a transkripčnej aktivity daného génu. Napríklad zníženie úrovne expresie LDL receptora v dôsledku mutácie v promótorovej oblasti povedie k presne tej istej hypercholesterolémii, ktorá by bola pozorovaná, ak by boli syntetizované normálne množstvá funkčne defektného receptora, ktoré by nemohli viazať alebo internalizovať lipoproteíny.

Zmeny v štruktúre proteínov spôsobené substitúciami aminokyselín alebo narušením spracovania mRNA v dôsledku mutácií v miestach zostrihu vedú k výskytu abnormálnej mRNA a proteínov, ktoré podliehajú zrýchlenej degradácii, čo vedie k zníženiu celkového množstva aktívneho proteínu. Napríklad tri najčastejšie chybné alely génu pre tiopurín metyl transferázu kódujú rýchlo degradujúce proteíny, čo vedie k prudkému poklesu aktivity enzýmu, ktorý je sprevádzaný zvýšenou citlivosťou pacientov na tiopuríny. V iných prípadoch, ako napríklad pri a-talasémii, je možné pozorovať deléciu celého génu, čo vedie k úplnej neprítomnosti produktu.

Mechanizmy straty skutočnej funkčnej aktivity proteínu môžu byť veľmi rôznorodé. V dôsledku toho môžu mutácie

nahradenie aminokyselín, ktoré zohrávajú kľúčovú úlohu v štruktúre alebo katalytickej aktivite. V dôsledku mutácií môže dôjsť k narušeniu normálneho spracovania alebo transportu proteínov. Napríklad najčastejšia mutácia spôsobujúca cystickú fibrózu, delécia fenylalanínu v polohe 506 génu CFTR, neovplyvňuje syntézu alebo funkčnú aktivitu tohto proteínu, ale narúša jeho intracelulárny transport, v dôsledku čoho nie je začlenený do plazmatickej membrány, a preto stráca svoju schopnosť fungovať. ako chlórový kanál.

Mutácie so stratou funkcie spravidla vedú k ochoreniam s recesívnym spôsobom dedičnosti. Je to spôsobené skutočnosťou, že na plné fungovanie metabolickej dráhy je zvyčajne dosť množstva aktívneho proteínu, ktorý je produkovaný jednou normálnou alelou. A väčšina z týchto chorôb.

Menej časté sú prípady, keď množstvo syntetizovaného proteínu je nedostatočné. V tomto prípade sa ochorenie začne objavovať, aj keď je jedna mutantná alela a dedičnosť sa stáva dominantnou. O takýchto ochoreniach je málo známe, jedným z nich je familiárna hypercholesterolémia spôsobená defektom génu LDL receptora. Toto ochorenie je tiež charakterizované účinkom dávky génu, čo sa prejavuje v skutočnosti, že familiárna hypercholesterolémia je oveľa homogénnejšia v porovnaní s heterozygotmi.

Dominantný typ dedičnosti sa prejavuje, keď mutantný proteín nielenže stráca svoju aktivitu, ale tiež interferuje s funkciou produktu normálnej alely v heterozygotoch. Táto situácia bola zahrnutá do literatúry nazývanej dominantne negatívny efekt. Tento účinok sa nachádza v prípade multimérnych proteínov, ktoré zahŕňajú najmä kolagény alebo dimérne transkripčné faktory.

MUTÁCIE S AKVIRIZAČNÝMI FUNKCIAMI

Zo širokej škály funkcií na zvýšenie mutácie sú najzaujímavejšie z hľadiska klinickej biochémie prípady, keď proteín získava novú funkciu. Novo získaná funkcia sa môže vyskytovať na takých úrovniach, ako je interakcia enzýmu s novým substrátom, ireverzibilná aktivácia proteínu prenášajúceho signál alebo iónový kanál, narušenie normálneho procesu inaktivácie enzýmu, abnormálna oligomerizácia proteínu alebo syntéza chimérického proteínu.

Strhnutie Ala je dobrým príkladom získania funkcie.₃₆₆-Sivá v géne GNAS1 kódujúca a-podjednotku Gs viažuceho heterotrimérny GTP. Tento proteín viaže receptory 7-doménových transmembránových hormónov s adenylát cyklázou. Mutácia vedie k dvojitej zmene vlastností proteínov. Po prvé, zrýchlenie uvoľňovania HDP a teda zvýšenie podielu GTP-viazaného (aktívneho) proteínu ασ, čo vedie k konštitutívnej aktivácii adenylátcyklázy. Po druhé, proteín sa termolabilne pri 37 ° C. V tomto ohľade, vo všetkých orgánoch, s výnimkou semenníkov, Gs aktivita klesá, čo vedie k rozvoju dedičnej osteodystrofie Albright. A v semenníku, kde je teplota nižšia, je proteín Gs nevratne aktivovaný, čo vedie k testoxikóze.

Najčastejším dôvodom na získanie funkcie je zvýšená expresia génu alebo porušenie miesta alebo času jeho expresie, čo je najcharakteristickejšie pre malígne transformované bunky.

Pre mutácie s nadobudnutím funkcie je spravidla charakteristický dominantný typ dedičnosti. V tých zriedkavých prípadoch, keď sú mutácie so získaním funkcie v homozygotnom stave, sa pozorujú veľmi závažné formy ochorenia, často s prenatálnou mortalitou. Príkladom je homozygotná achondroplázia, najčastejšia príčina trpaslíka, ktorá je spôsobená mutáciami v géne FGFR3, ktorý kóduje receptor pre rastový faktor fibroblastov. Delécie miesta chromozómu, na ktorom sa FGFR3 nachádza v iných chorobách, nevedú k abnormalitám kostry charakteristickým pre achondropláziu, čo naznačuje zvýšenie alebo získanie funkcie pri tomto ochorení. Achondroplázia sa vždy nachádza v heterozygotnej forme, pretože homozygotnosť pre tento znak je letálna.

ZÁSADY HĽADANIA MUTÁCIÍ

Všeobecný prístup k vyhľadávaniu mutácií v ľudskej genómovej DNA je založený na viacerých princípoch.

Použitie jednej alebo druhej metódy v diagnostike DNA závisí od dostupnosti informácií o možnom type mutácie u daného pacienta. V prípadoch, kde typ mutácie nie je známy, sa na detekciu akýchkoľvek rozdielov v nukleotidovej sekvencii mutantných a normálnych génov používajú skríningové metódy. Ak je mutácia známa, napríklad bola už identifikovaná u príbuzných, na vyšetrenie sa používajú iné, jednoduchšie.

a zároveň účinnejšie metódy, ktoré možno nazvať metódami detekcie známych mutácií.

Okrem toho, bez ohľadu na smerovosť (skríning alebo detekcia) zvolenej metódy, je potrebné vziať do úvahy, že jedna skupina metód je založená na špecificite párovania nukleotidov pri tvorbe dvojitého vlákna DNA a druhá na rozpoznaní sekvencie DNA enzýmami.

Pre prvú skupinu metód sa ako referenčná sekvencia použijú fragmenty sekvencie študovaného génu, zodpovedajúce divokému typu, t.j. najbežnejšie v populácii. Môže to byť buď krátky oligonukleotidový primér (približne 20 nukleotidov) alebo dlhší DNA fragment použitý na hybridizáciu. V prípade, že DNA pacienta obsahuje mutáciu v oblasti pokrytej vzorkou, nie je možná úplná hybridizácia medzi mutantnou alelou a vzorkou. To vedie buď k neprítomnosti produktu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) alebo k vytvoreniu neadekvátneho duplexu DNA obsahujúceho nepárové nukleotidové oblasti, ktoré sú detegované rôznymi chemickými alebo enzymatickými metódami.

Klasickým príkladom metódy založenej na rozpoznávaní sekvencií DNA enzýmami je použitie reštrikčných enzýmov, enzýmov, ktoré štiepia DNA v oblastiach obsahujúcich striktne jednotlivé sekvencie s dĺžkou 4-8 nukleotidov. Výskyt odchýlok v nukleotidovej sekvencii v dôsledku mutácie môže viesť buď k strate už existujúceho miesta štiepenia akéhokoľvek reštrikčného enzýmu, alebo naopak k jeho vzhľadu. V rovnakej skupine metód sa používajú enzýmy DNA polymerázy. Tieto enzýmy syntetizujú komplementárny reťazec v presnom súlade so sekvenciou jednovláknovej matrice. Pomocou označených nukleotidových blokov je možné určiť, v ktorej sekvencii sú nukleotidy umiestnené v danej matrici. Tento princíp je základom enzymatického sekvenovania (stanovenie nukleotidovej sekvencie) podľa metódy Sangera, ako aj jeho zjednodušených verzií, určených na stanovenie nukleotidovej sekvencie krátkych úsekov DNA (mini-sekvenovanie).

V prevažnej väčšine prípadov sa pred analýzou vlastného mutácie amplifikuje študovaný fragment genómu pacienta pomocou PCR. Cieľom PCR je zvyčajne jednoduché násobenie.

počet kópií tohto fragmentu, ktorý umožňuje technicky následnú analýzu DNA (Obr. 4.3). Vo väčšine variantov PCR v heterozygótoch sa normálne aj mutantné alely amplifikujú s rovnakou účinnosťou a ich diskriminácia sa uskutočňuje v nasledujúcich stupňoch. Existuje aj špecifická alela

Obr. 4.3. Schéma polymerázovej reťazovej reakcie

PCR, v ktorej sa používajú priméry, ktoré sú homológne k normálnej alebo mutantnej alele, ktorá umožňuje prítomnosť mutácie, ktorá sa má stanoviť už v štádiu PCR prítomnosťou alebo neprítomnosťou amplifikačného produktu.

Ďalšou univerzálnou metódou bežne používanou na diagnostiku mutácií je sekvenovanie DNA. Sekvenovanie sa používa na vyhľadávanie neznámych mutácií a na potvrdenie porušení zistených inými metódami. Existujúce metódy umožňujú sekvenovanie produktov PCR priamo, obchádzajúc klonovanie PCR fragmentu v baktériách. Výhodou sekvencovania je všestrannosť a vysoko informatívne. Hlavným obmedzením tejto metódy je vysoká cena, ktorá neumožňuje jej použitie ako hlavnej pri vyhľadávaní mutácií.

Počet existujúcich metód analýzy mutácií je extrémne veľký a ich opis bez zveličenia bude vyžadovať samostatnú knihu. Nižšie sú opísané len tie metódy, ktoré sú lepšie prispôsobené na použitie v klinickej praxi, t.j. spĺňajú tieto požiadavky: dostatočná citlivosť na identifikáciu mutácií, dobrá reprodukovateľnosť, nízke náklady a možnosť automatizácie.

METÓDY MUTAČNÉHO OBRAZOVANIA

Metódy mutačného skríningu sa používajú v prípadoch, keď charakter mutácie nie je známy a klinický obraz dedičného ochorenia naznačuje, v ktorých konkrétnych génoch by mohlo dôjsť k preskupeniu. Napríklad prítomnosť hypercholesterolémie typu IIa v kombinácii so šľachtovými xantómami indikuje prítomnosť familiárnej hypercholesterolémie a navrhuje, aby sa mutácia hľadala v génoch spojených so zachytávaním LDL buniek, primárne v géne LDL receptora. Pretože mutácie v tomto géne s familiárnou hypercholesterolémiou sú veľmi rozmanité a môžu ovplyvniť celú dĺžku génu, je potrebné analyzovať veľké časti DNA. Sekvenovanie takéhoto dlhého génového fragmentu je príliš drahé, preto sa používajú jednoduchšie metódy.

ANALÝZA MAKRORESTORUJÚCEHO BLOTTINGU DNA

Hľadanie makroskopickej DNA pomocou Southern blottingu. Pri tejto metóde sa genómová DNA pôvodne fragmentuje použitím reštrikčného enzýmu, po čom sa výsledná

DNA fragmenty sa oddelia gélovou elektroforézou, denaturujú a prenesú na nitrocelulózovú membránu. DNA na výtlačku získanej z gélu (blot) sa inkubuje so značeným fragmentom študovaného génu, ktorý hybridizuje s fragmentmi genómovej DNA, ktoré tento gén obsahujú. V prítomnosti makroskopickej DNA, ktorá ovplyvňuje tento gén, sa súbor alebo veľkosť fragmentov, s ktorými značená vzorka hybridizuje, bude líšiť od normy.

Obr. 4.4. Heteroduplexová analýza

HETERODUPLEXNÁ ANALÝZA Hľadanie mikrodelekcií / inzercií s veľkosťou menej ako 25 bázových párov, ako aj substitúcie jednotlivých nukleotidov je ťažšie. Na ich analýzu sa často používajú špeciálne varianty elektroforetických metód. Jedným z najjednoduchších je heteroduplexná analýza (Obr. 4.4). V tejto metóde sa vzorka obsahujúca zmes normálneho (referenčného) a amplifikovaného DNA fragmentu, ktorý sa skúma, zahrieva na denaturáciu DNA a potom sa ochladí s obnovením štruktúry dvojvláknovej DNA. Pretože prítomnosť malých rozdielov v nukleotidovej sekvencii nebráni hybridizácii, časť výsledných duplexov pozostáva z referencie a testovanej DNA. V oblastiach referencie a testovacej DNA, ktoré sa líšia v zložení nukleotidov, nie je možné normálne párovanie nukleotidov a vytvára sa takzvaný nesúlad. Dvojvláknová DNA, ktorá má nesúlad vo svojej štruktúre, na elektroforéze migruje odlišne ako plne komplementárny duplex, čo umožňuje detekciu abnormálne migrujúcich fragmentov po farbení DNA.

ANALÝZA POLYMORFISMU ZHODY SINGLE-GRANN DNA

Ďalšou populárnou elektroforetickou metódou mutačného skríningu je konformačný polymorfizmus jednovláknového konformačného polymorfizmu (SSCP). Princíp metódy je založený na skutočnosti, že ak je denaturovaná zahrievaním, DNA je prudko ochladená, nebudú tvorené prevažne dvojvláknové duplexy, ale krátke dvojvláknové oblasti v každom jednovláknovom DNA fragmente (Obr. 4.5). Zvyčajne sa vytvára niekoľko relatívne stabilných variantov, ktoré v dôsledku odlišnej priestorovej konformácie migrujú rôznymi spôsobmi na elektroforéze. Oblasti intrachainovej komplementarity sú zvyčajne krátke a akákoľvek zmena v dôsledku dokonca aj nukleotidovej substitúcie zvyčajne vedie k vymiznutiu tejto formy vnútroreťazcového duplexu. Výsledkom je, že distribúcia a intenzita pásov jednovláknovej DNA sa mení na elektroforegrame. Táto metóda nehovorí nič o povahe rozdielov v nukleotidovej sekvencii, takže abnormálne vzorky musia byť sekvenované.

Obr. 4.5. Analýza polymorfizmu konformácie jednovláknovej DNA

ELEKTROFORÉZA DNA ARCHITEKTÚRY Β DENATURANT GRADIENT Viac elektricky reprodukovateľná a informatívna ako SSCP je elektroforetická analýza DNA v denaturačnom gradiente (Obr. 4.6). Je zrejmé, že akákoľvek substitúcia nukleotidov povedie k zmene sily duplexu DNA a bude denaturovať na jednotlivé reťazce pri abnormálnej teplote alebo koncentrácii denaturačného činidla v porovnaní s normálnou sekvenciou. Pri tejto metóde sa elektroforéza uskutočňuje v polyakrylamidových géloch obsahujúcich vyššiu koncentráciu denaturantu v spodnej časti než v hornej časti. Počas elektroforézy sa normálne a mutantné DNA fragmenty denaturujú v rôznych častiach gélu. Keďže mobilita výsledných jednotlivých reťazcov je oveľa nižšia, t

Obr. 4.6. Elektroforéza v denaturačnom gradiente

ako dvojvláknová DNA (kvôli konformačným charakteristikám jednovláknovej DNA), denaturovaný fragment prudko spomaľuje migráciu, zatiaľ čo dvojvláknová pokračuje v pohybe. Result V dôsledku toho migrujú normálne a mutantné fragmenty DNA v rôznych vzdialenostiach v géli. Niekedy ako denaturant použitie nie je chemická látka, ale teplotný gradient.

DENATURING FUEL-EFFICIENT LIQUID

CHROMATOGRAFIA Rozdiely v sile normálnych a mutantných duplexov možno tiež detegovať pomocou denaturačnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. V tomto spôsobe je fragment DNA, podobne ako elektroforetické metódy opísané vyššie, vystavený gradientu denaturačných činidiel, ale analýza DNA sa uskutočňuje chromatografickou metódou s použitím spektrofotometrickej detekcie. Táto metóda je veľmi citlivá a ľahko sa automatizuje, a preto sa stále viac používa na diagnostiku DNA.

CHEMICKÁ DETEKCIA NEBALENÝCH NUKLEOTIDOV Druhá skupina metód je založená na detekcii mutácií pomocou enzýmov alebo chemického spracovania, ktoré špecificky ničí oblasti nekomplementárneho párenia.

Analyzovaný DNA fragment je denaturovaný, zmiešaný s kontrolnou vzorkou obsahujúcou normálnu DNA a ochladený za vzniku duplexov, z ktorých niektoré, ak má pacient mutácie, budú obsahovať oblasti nepárovaných báz. Ošetrenie DNA heteroduplexu hydroxylamínom alebo oxidom osmičelým vedie k modifikácii nepárových nukleotidov obsahujúcich cytozín a tymidín. Následné spracovanie piperidínom vedie k štiepeniu DNA na nukleotide. Výsledkom je, že veľkosť DNA je zachovaná v normálnych vzorkách a mutantné obsahujú súbor fragmentov zodpovedajúcich mutáciám ovplyvňujúcim nukleotidy C alebo T. Táto metóda nie je široko používaná, pravdepodobne kvôli vysokej toxicite použitých činidiel.

OCHRANA PROTI RÁMU V inom spôsobe sa prítomnosť nepárovaných nukleotidov stanoví pomocou enzýmu RNázy. Táto metóda využíva značenú RNA sondu zodpovedajúcu normálnej génovej sekvencii, ktorá hybridizuje so skúmaným fragmentom DNA (Obr. 4.7). Ako súčasť duplexu DNA / RNA je RNA rezistentná na RNázu, preto sa táto metóda nazýva ochrana proti RNáze. Avšak v oblastiach odlišných v nukleotidovej sekvencii medzi vzorkou a analyzovanou vzorkou nenastáva párovanie nukleotidov. Tvorba fragmentov RNA sa zaznamenáva elektroforézou. Táto metóda je jednou z najcitlivejších a skríningovo špecifických mutácií, ale nebola široko používaná, zrejme v dôsledku nepohodlia práce s labilnými RNA sondami. Existujú aj iné metódy založené na enzýmovom rozpoznaní nepárovaných báz; nie je jasné, ako široko sa budú používať v klinickej diagnóze.

SCREENING DIAGNOSTICKÝCH MUTÁCIÍ Elektroforetické metódy mutačného skríningu sú neadekvátnou senzitivitou, zvyčajne detegujú len približne polovicu mutácií a polymorfizmov v analyzovaných fragmentoch a iba citlivosť denaturácie.

elektroforéza sa blíži 100%. V kombinácii s relatívne nízkymi nákladmi a možnosťou automatizácie je táto metóda čoraz obľúbenejšia.

Ďalším znakom skríningových metód je, že s pozitívnymi výsledkami je potrebná ďalšia sekvenčná analýza alebo analýza reštrikčným enzýmom, pretože skríningové metódy nie sú

Obr. 4.7. Metóda ochrany RNázy

poskytnúť akékoľvek informácie o povahe nukleotidových rozdielov. Pri diagnostike DNA nestačí detegovať odchýlku v nukleotidovej sekvencii u pacienta, čo vedie k nahradeniu kódovanej aminokyseliny. Je potrebné potvrdiť, že táto aminokyselinová substitúcia je funkčne významná. Priama metóda spočíva v získaní rekombinantného mutantného proteínu a stanovení jeho aktivity. Tento časovo náročný a nákladný prístup sa využíva hlavne na výskumné účely. V praxi sa častejšie riadia typom aminokyselinovej substitúcie. V prípade, že normálne a mutantné aminokyseliny patria do rôznych štruktúrnych tried, pravdepodobnosť funkčných zmien v proteíne je vyššia. Pravdepodobnosť dysfunkcie proteínu je ešte vyššia, ak mutácia ovplyvňuje evolučne konzervované časti génu, t.j. tie ustanovenia, v ktorých je rovnaká aminokyselina prítomná v niekoľkých druhoch cicavcov. Prítomnosť takýchto miest zvyčajne ovplyvňuje syntézu, transport alebo fungovanie proteínu a akákoľvek zmena v nich ovplyvňuje aktivitu proteínu. Napríklad sekvenčná analýza génu LDL receptora čínskeho škrečka, králika, potkana, myši a Xenopus laevis demonštrovala 81, 79, 77, 76 a 70% homológiu s ľudským receptorom. Databáza UMD-LDLR prístupná cez internet obsahuje množstvo programov na analýzu mutácií v géne LDL receptora, vrátane možnosti analyzovať konzervativizmus každého génového segmentu.

Ďalšie informácie o patogenite mutácie možno získať vyšetrením príbuzných pacienta. V prípade, že rovnaká mutácia je prítomná u príbuzných pacientov s príznakmi tohto ochorenia (napríklad zvýšená hladina cholesterolu pri familiárnej hypercholesterolémii), ale u zdravých jedincov chýba (viac ako 100 darcov sa zvyčajne vyšetruje bez príznakov tohto ochorenia), pravdepodobnosť, že Táto mutácia je patogénna, veľmi vysoká.

Všeobecne platí, že napriek absolútnej citlivosti metód mutačného skríningu je pomer medzi informačným obsahom a nákladmi na tieto metódy pomerne vysoký a v praxi sa široko používajú. Treba však mať na pamäti, že ich negatívna prediktívna sila je malá. Inými slovami, absencia akýchkoľvek znakov vzorky DNA pri analýze skríningovými metódami neznamená, že táto DNA neobsahuje mutácie.

METÓDY DETEKCIE MUTÁCIÍ

V prípade, že sú známe možné varianty genetických preskupení a nie je ich veľa, môžete použiť metódy, ktoré sú rýchlejšie a lacnejšie ako metódy mutačného skríningu. Tieto metódy sú založené buď na DNA hybridizácii, alebo na schopnosti reštrikčných enzýmov rozpoznať dobre definované nukleotidové sekvencie alebo DNA polymerázy na syntézu DNA, ktorá je komplementárna k matrici (mini-sekvencovanie).

Obr. 4.8. Analýza obmedzenia

ANALÝZA OBMEDZENIA Najjednoduchšou metódou detekcie mutácií je reštrikčná analýza (Obr. 4.8). Základom tejto metódy je veľmi vysoká špecificita reštrikčných endonukleáz vzhľadom na určité nukleotidové sekvencie. Každý z týchto bakteriálnych enzýmov rozpoznáva striktne individuálnu sekvenciu 4-8 nukleotidov a štiepi dvojité vlákno DNA vnútri alebo v blízkosti tohto miesta. Stačí nahradiť jeden nukleotid, aby sa porušilo obmedzenie tohto enzýmu. V tých prípadoch, keď je polymorfný nukleotid súčasťou restrikčného miesta, môže byť genotypovaný so 100% spoľahlivosťou pomocou reštrikčného enzýmu. Nukleotidové substitúcie najčastejšie porušujú existujúce reštrikčné miesta, ale niekedy vytvárajú nové miesta. Nevýhodou tohto spôsobu je, že polymorfné nukleotidy nie vždy ležia v rozpoznávacích miestach akejkoľvek reštrikcie. Čiastočné riešenie je možné v prípadoch, keď oblasť, v ktorej sa mutácia nachádza, obsahuje aspoň niektoré nukleotidy, ktoré tvoria restrikčné miesto. Kompletné restrikčné miesto môže byť vytvorené umelo počas PCR. Na tento účel sa použijú priméry, ktoré úplne nezodpovedajú sekvencii nukleotidov v oblasti mutácie, ale obsahujú 1-2 nekomplementárne nukleotidy, ktoré dopĺňajú reštrikčné miesto, ktoré bude obsahovať polymorfný nukleotid. Zavedenie malého počtu nekomplementárnych báz zvyčajne mierne znižuje účinnosť PCR, preto sa po amplifikácii objaví v produkte nové reštrikčné miesto, v ktorom je tiež zahrnutý polymorfný nukleotid. Ďalšia reštrikčná analýza sa uskutočňuje rovnakým spôsobom ako v štandardnej metóde.

ALLELSPECIFIC PCR V niektorých prípadoch sa môže PCR použiť na obohacovanie študovaného fragmentu genómovej DNA, ale na priamu detekciu mutácie (Obr. 4.9). V tomto uskutočnení jeden z primérov hybridizuje s DNA oblasťou, v ktorej sa nachádza polymorfný nukleotid. Teplota anelovania primérov je vybraná tak, aby väzba priméru a následná amplifikácia prebiehala iba s úplnou zhodou sekvencií DNA a primérov. Napríklad, keď sa primér zodpovedajúci mutantnej sekvencii viaže na normálnu DNA, vytvorí sa nepárový nukleotid, ktorý znižuje silu priméru viažuceho sa na DNA. Pri dostatočne vysokom teplotnom základnom žíhaní

Obr. 4.9. Alelovo špecifická polymerázová reťazová reakcia

vo všeobecnosti prestala viazať na normálnu alelu, PCR nepostupuje a produkt sa neakumuluje. Zvyčajne sa paralelne uskutočňuje reakcia s primerom zodpovedajúcim normálnej alele. Táto reakcia slúži ako pozitívna kontrola, ktorá ukazuje normálny priebeh amplifikácie. Pretože prítomnosť jedného chybného párovania môže mierne znížiť silu viazania priméru na DNA, niekedy sa do sekvencie priméru zavedie druhé nesúlad s cieľom ďalej destabilizovať duplex a znížiť výťažok produktu v prítomnosti nepárového nukleotidu v polymorfnej oblasti.

PCR AL REAL REMAINS

Výhoda alelicky špecifickej PCR metódy opísanej vyššie je zníženie počtu fáz v analytickom postupe, pretože nevyžaduje spracovanie produktu reštrikciami alebo použitím komplexných elektroforetických metód.

Ešte viac sa táto metóda urýchľuje použitím PCR v reálnom čase (RT-PCR). Pri tejto metóde nie je tvorba produktu monitorovaná elektroforézou, ako je to pri štandardnej PCR metóde, ale priamo počas PCR na akumuláciu dvojvláknovej DNA v reakčnom médiu. Akumulácia DNA sa stanoví po každom polymerizačnom cykle zvýšením fluorescencie farbiva SYBR Green alebo jeho analógov, ktorých fluorescencia sa dramaticky zvyšuje pri interakcii s dvojvláknovou DNA, ale nezávisí od prítomnosti nukleotidov alebo primérov. Nástroje na RT-PCR sú kombináciou PCR zosilňovača a fluorimetra. Po dokončení amplifikácie sa môže špecificita získaného produktu stanoviť meraním teploty topenia, ktorá sa sleduje redukciou fluorescencie SYBR Green.

TESTOVANIE TAQMAN Existujú aj iné spôsoby registrácie produktu PCR priamo v reakčnej zmesi bez elektroforézy. Metóda, patentovaná Hofmanom LaRochom, je založená na detekcii amplifikovanej DNA s použitím oligonukleotidovej sondy, ktorá hybridizuje s centrálnou časťou amplifikovanej sekvencie. Na koncoch oligonukleotidových vzoriek, nazývaných TaqMan, sú nukleotidy označené dvoma rôznymi fluorescenčnými farbivami, z ktorých jedno zháša fluorescenciu druhej. V dôsledku kalenia je hladina fluorescencie druhého farbiva malá. Taq polymeráza, ktorá dokončuje nové vlákno z jedného z primérov, rozdeľuje vzorku TaqMan, ktorá sa viaže na stred amplifikovanej oblasti DNA, vďaka svojej exonukleázovej aktivite, čo vedie k tomu, že fluorescenčne značené nukleotidy sa uvoľňujú do roztoku a efekt zhášania zmizne, pretože je pozorovaný iba v prípade, keď sú fluorofory umiestnené blízko seba. Výsledkom je, že fluorescencia farbiva sa zvyšuje viac, čím viac oligonukleotidových vzoriek je zničených DNA polymerázou počas amplifikácie, t.j. čím viac produktu sa vytvorilo. Táto metóda sa tiež používa na analýzu mutácií. Na tento účel sa použijú dve TaqMan vzorky, značené rôznymi pármi fluoroforov a líšiacimi sa v nukleotidovej sekvencii v polymorfnej oblasti, z ktorých jedna zodpovedá divokému typu a druhá mutantnému. Degradácia vzorky DNA polymerázy

Obr. 4.10. Sondy TaqMan. P - reportérové farbivo, fluorescencia T - quencher

sa uskutočňuje pri teplote, pri ktorej sa skladujú len komplementárne komplexy medzi analyzovaným fragmentom a vzorkami. Zvýšením fluorescencie farbív, ktoré tvoria normálnu alebo mutantnú vzorku, je možné určiť, ktoré varianty sú prítomné v analyzovanej vzorke. Táto metóda vám umožňuje spoľahlivo rozlíšiť medzi heterozygotnými a homozygotnými nosičmi mutácií.

MOLEKULÁRNE PEČIATKY V molekulárnej metóde je implementovaná iná metóda detekcie mutácií založená na účinku zhášania fluorescencie (Obr. 4.11). Oligonukleotid sa nazýva bója, ktorého 3'- a 5'-konce sú značené dvoma farbivami, z ktorých jedno pôsobí ako tlmiace činidlo. Na rozdiel od vzoriek TaqMan, bóje sú dlhšie a obsahujú blízko konca krátkych komplementárnych častí navzájom, ktoré sa pri bežnej teplote navzájom žíhali, aby vytvorili vlásenkovú štruktúru. V tomto prípade sa farbivá nachádzajúce sa na koncoch oligonukleotidu navzájom približujú a fluorescencia jedného farbiva sa zastaví iným farbivom. V strede bóje nukleotidová sekvencia zodpovedá skúmanej oblasti DNA. Po denaturácii zahrievaním, čo vedie k roztaveniu vlásenkovej časti, sa zmes DNA s bójami ochladí, čo umožňuje vytvorenie duplexu bóje s analyzovanou DNA. Po ďalšom ochladení sa kolíky znovu vytvoria vo voľných bójkach a fluorescencia sa zníži. Naopak v majákoch viazaných na analyzovanú DNA,

Obr. 4.11. Metóda molekulových majákov. P - reportérové farbivo, fluorescencia T - quencher

farbivá zostávajú od seba vzdialené a ich fluorescencia zostáva vysoká. Hybridizácia testovanej DNA s koreňmi obsahujúcimi normálnu alebo mutantnú nukleotidovú sekvenciu v centrálnej časti umožňuje stanovenie genotypu testovanej DNA.

HYBRIDIZÁCIA S VŠETKÝMI ŠPECIFICKÝMI

Táto metóda je založená na hybridizácii testovanej DNA s oligonukleotidmi homológnymi s mutačným miestom a okolitou sekvenciou. Táto metóda existuje v dvoch formách. Niekedy je produkt PCR imobilizovaný na pevnej báze a pridané značené oligonukleotidy v roztoku. Podmienky premývania sa volia tak, aby sa zničili duplexy obsahujúce nepárové bázy. V dôsledku toho zostávajú na matrici len oligonukleotidy, ktoré sú 100% komplementárne k analyzovanej DNA. Pridaním oligonukleotidov zodpovedajúcich sekvencii k normálnemu alebo mutantnému variantu je možné určiť, ktorý nukleotid je prítomný v analyzovanej DNA. V druhom variante tohto spôsobu sú oligonukleotidy imobilizované na matrici, s ktorou značený produkt PCR hybridizuje.

Výhodou spôsobu hybridizácie s oligonukleotidmi je možnosť jeho miniaturizácie, keď je na mikročipe imobilizovaný široký súbor oligonukleotidov, čo umožňuje simultánne detekovať mnoho mutácií. Hlavným problémom tejto metódy je potreba prísneho výberu podmienok pre hybridizáciu a premytie neúplne komplementárnej DNA. Nie je jasné, ako široko sa táto metóda bude používať v praktickej DNA diagnostike.

ALL-SPECIFIC LIGASE REACTION Účinnou metódou na detekciu substitúcií s jedným nukleotidom a krátkymi preskupeniami je ligázová reakcia (Obr. 4.12). Analyzovaná DNA hybridizuje s dvoma oligonukleotidmi, z ktorých jeden končí nukleotidom, komplementárnym k polymorfnému miestu a druhý priamo k nemu susedí. Po skončení hybridizácie zosieťuje enzým DNA ligáza oligonukleotidy za vzniku dlhšieho fragmentu, ktorý sa výrazne líši od pôvodných oligonukleotidov v mobilite.

Obr. 4.12. Alelicky špecifická ligázová reakcia

s elektroforézou. Ak oligonukleotidy nie sú úplne komplementárne k fragmentu DNA a po hybridizácii sa v polymorfnej oblasti vytvorí nepárový nukleotid, ligáza nezosieťuje takéto oligonukleotidy a dlhý fragment sa nevytvára. Uskutočnením ligázovej reakcie s jednou spoločnou a jednou z dvoch alelicky špecifických vzoriek je teda možné genotypovať vzorku DNA pre daný nukleotid.

V tomto spôsobe je produkt PCR hybridizovaný s väzbou oligonukleotidu na b'-strane polymorfného miesta (obrázok 4.13). Po hybridizácii sa k reakčnej zmesi pridá DNA polymeráza a jeden zo štyroch modifikovaných nukleotidov. V tejto reakcii sa používajú fluorescenčne značené dideoxynukleotidy, v dôsledku čoho DNA polymeráza môže dokončiť iba jeden nukleotid komplementárny k tomu, ktorý sa nachádza v analyzovanej polohe. Preto sa reakcia uskutoční iba v skúmavke, kde sa pridá nukleotid, ktorý je komplementárny k analyzovanému. V niektorých prípadoch sú všetky štyri nukleotidy prítomné v reakčnej zmesi, ale značené rôznymi farbivami. Fluorescenčná analýza na štyroch vlnových dĺžkach umožňuje určiť, ktorý nukleotid je aktivovaný, a preto je analyzovaný nukleotid s ním komplementárny. Pretože táto metóda využíva rovnaký princíp ako pri enzymatickom sekvenovaní DNA, často sa nazýva mini-sekvencovanie.

Existujú aj iné spôsoby stanovenia mutácií na základe aktivity DNA polymerázy. V jednom z nich, nazývanom pyrosekvenovanie, je každý krok predĺženia reťazca DNA polymerázy zaznamenaný tvorbou pyrofosfátu, ktorý je monitorovaný pomocou konjugovaných enzymatických reakcií, čo vedie k prepuknutiu chemiluminiscencie v reakcii na tvorbu pyrofosfátu (Obrázok 4.14). Táto metóda umožňuje sekvenovanie len veľmi krátkych úsekov DNA, takže jej hlavným použitím je analýza mutácií. Nukleotid, ktorý sa má analyzovať, sa identifikuje pridaním toho, ktorý zo štyroch nukleotidov (v tomto spôsobe sa použijú bežné nukleotidy) majú za následok vypuknutie chemiluminiscencie.

Obr. 4.13. minisequencing

Obr. 4.14. Princíp sekvenovania DNA

DETEKCIA MUTÁCIÍ DIAGNOSTIKA Pri správnom používaní detekčné metódy určujú prítomnosť alebo neprítomnosť mutácií s veľmi vysokou citlivosťou a špecifickosťou, čo umožňuje, aby sa informácie získané týmito metódami použili na vykonanie veľmi dôležitých rozhodnutí, ako je potreba potratu počas prenatálnej diagnostiky.

Existujú dve metódy prenatálnej diagnostiky. Amniocentéza spočíva vo výbere asi 10 ml plodovej vody cez brušnú stenu (obr. 4.15). Optimálny termín

Obr. 4.15. amniocentéza

- 16. týždeň tehotenstva. Fetálne bunky sa izolujú z kvapaliny centrifugáciou a buď sa okamžite analyzujú pomocou PCR alebo sa umiestnia do kultúry. Bunky v kultúre sa delia a po určitom čase sú dosť na vykonanie chromozomálnej analýzy a neskôr biochemické. Druhá metóda, biopsia choriových klkov, je možná v skorších štádiách tehotenstva, v týždni 10-12 (obr. 4.16). Tento postup pozostáva z transabdominálnej alebo transcervikálnej biopsie choriových klkov. Choriónové bunky sa môžu kultivovať alebo analyzovať okamžite, ak je dostatok materiálu na analýzu DNA. Ak sa zistia chromozomálne abnormality alebo mutácie, rodičia môžu prerušiť tehotenstvo.

Vykonávanie prenatálnej diagnostiky mutácií má zmysel, keď existuje spoľahlivá metóda na detekciu mutácie, ktorá je prítomná v danej rodine. V niektorých prípadoch to možno určiť

Obr. 4.16. Choriová biopsia

či plod plodil dedičné ochorenie, nevedel presné umiestnenie mutácie, ale spoliehal sa na analýzu genetického spojenia ochorenia v rodine. Nie je to však vždy možné, pretože na analýzu väzby sú potrebné vzorky DNA od niekoľkých chorých príbuzných a veľký počet zdravých členov rodiny.

4.5.2. VLASTNOSTI DIAGNOSTICKEJ APLIKÁCIE DNA

Maximálna diagnostická hodnota genetického testovania sa pozoruje v prípadoch, keď existuje vysoká korelácia medzi prítomnosťou genetického defektu a pravdepodobnosťou vzniku patológie, to znamená pre ochorenia s vysokou penetranciou.

Takéto ochorenia majú neustály tlak prirodzeného výberu, v dôsledku čoho je ich frekvencia v bežnej populácii zvyčajne malá. V tomto ohľade je väčšina aplikovaných genetických testov spojená s diagnostikou zriedkavých foriem chorôb. Dokonca aj najbežnejšie formy ľudských monogénnych ochorení, opísané nižšie, sa klinicky prejavujú nie častejšie ako u jednej osoby z niekoľkých stoviek.

Bežné ľudské ochorenia, ako je hypertenzia, cukrovka, kardiovaskulárne ochorenia, hoci sú závislé od genetických faktorov, majú nízku penetráciu, komplexnú, premenlivú a nedostatočne študovanú genetickú štruktúru, preto aj napriek zrejmej potrebe hľadania genetickej predispozície k bežným ochoreniam, výsledky takýchto výskum v praxi je veľmi obmedzený.

FAKTORY ÚČINNOSTI Pomer informatívnosti výsledkov diagnostiky DNA a nákladov na jej implementáciu je do značnej miery determinovaný genetickou komplexnosťou ochorenia. Príklady zahŕňajú hemochromatózu, pri ktorej dve mutácie spôsobujú takmer všetky klinické prípady medzi bielou populáciou a familiárnu hypercholesterolémiu, ktorá môže byť spôsobená viac ako 800 mutáciami v géne receptora LDL, z ktorých žiadna nie je častejšia ako u 1% pacientov s familiárna hypercholesterolémia. Väčšina dedičných ochorení je v tomto rozsahu stredne pokročilá, približuje sa k familiárnej hypercholesterolémii, keď náklady na diagnostiku DNA môžu obmedziť jej implementáciu.

Za určitých podmienok sa môže znížiť zložitosť diagnózy, a teda aj jej náklady. To je možné v populáciách, v ktorých je genetická štruktúra ochorenia jednoduchšia ako v iných populáciách. Tento účinok je najvýraznejší v populáciách s tzv. Zakladateľským efektom. Tento genetický termín znamená, že významná časť populácie zdedila určitú mutáciu od jedného zo svojich predkov. V dôsledku tejto čisto náhodnej udalosti v tejto populácii je väčšina prípadov tohto ochorenia spôsobená touto mutáciou. Typickým príkladom súvisiacim s genetickým testovaním je populácia afrikánov, obyvateľov južnej Afriky severoeurópskeho pôvodu. Moderné Afrikánčania sú potomkami malého počtu rodín z Holandska, ktorí sa v 17. - 18. storočí presťahovali do Afriky. Medzi afrikánmi je familiárna hypercholesterolémia, ktorá vedie k včasnému rozvoju ischemickej choroby srdca, niekoľkokrát častejšia ako u európskej alebo americkej populácie. Okrem toho veľká väčšina (> 95%) prípadov familiárnej hypercholesterolémie v bielej populácii v Južnej Afrike je spôsobená prítomnosťou jednej z troch mutácií v LDL receptore. Takáto genetická homogenita ostro kontrastuje s genetickou štruktúrou familiárnej hypercholesterolémie v iných krajinách, kde sú opísané stovky mutácií, z ktorých žiadna nie je častejšia ako u 1-2% pacientov. Zdá sa, že niekoľko rodín prisťahovalcov (najmenej tri) malo mutácie, teraz nazývané afrikanerskimi, ktoré sa stali hlavnou príčinou familiárnej hypercholesterolémie v ich potomkoch. Z hľadiska praktickej medicíny je molekulárne genetické testovanie bielych ľudí v Južnej Afrike na prítomnosť familiárnej hypercholesterolémie pomerne účinným a relatívne lacným prístupom, ktorý umožňuje presymptomatickú diagnostiku tohto ochorenia. Na rozdiel od Južnej Afriky, iné krajiny vyžadujú oveľa drahší arzenál molekulárnych metód, aby takúto diagnózu.

Pri iných dedičných ochoreniach je tiež rozdiel vo frekvencii mutácií medzi populáciami. Napríklad mutácia cis₂₈₂

Pneumatika v géne HFE, vedúca k rozvoju hemochromatózy, je v európskych populáciách pomerne bežná, pričom frekvencia jej nosičov je až 10-15%. Naproti tomu v afrických, ázijských a austrálskych domorodých populáciách

Táto mutácia je veľmi zriedkavá. Predpokladá sa mutácia Cis₂₈₂-Pneumatika vznikla v Európe asi pred 2000 rokmi.

Okrem zakladateľského efektu je druhým biologickým mechanizmom, ktorý zjednodušuje vyhľadávanie mutácií aj v geneticky otvorenej populácii, prítomnosť horúcich mutačných bodov v génoch. Je dokázané, že pravdepodobnosť výskytu mutácií sa líši v oblastiach genómu s rôznym obsahom GC-nukleotidov. Tiež je známa sekvencia, v ktorej je DNA polymeráza a zastavená; v takýchto oblastiach sa sporadické delécie často nachádzajú v rôznych génoch. V dôsledku týchto faktorov nie sú mutácie rovnomerne rozdelené pozdĺž dĺžky génu, ale sú koncentrované v určitých oblastiach, čo zjednodušuje ich vyhľadávanie.

Pre efektívnu DNA diagnostiku sú teda potrebné informácie o najčastejších mutáciách vedúcich k rozvoju tohto ochorenia v populácii, do ktorej pacient patrí.

FAKTORY DIAGNOSTICKEJ HODNOTY

U mnohých dedičných metabolických porúch môže byť počas biochemickej analýzy podozrenie na prítomnosť ochorenia. Napríklad pacienti s familiárnou hypercholesterolémiou majú zvyčajne zvýšené hladiny LDL cholesterolu a pri hemochromatóze sa zvyšuje saturácia transferínu železom. Biochemické parametre sú u každého jedinca vystavené variabilite. Výsledkom je, že jednotlivcom, napríklad so zvýšenými hladinami LDL cholesterolu, sa odporúča opakovať testy v intervale 3 mesiacov, aby sa zabezpečilo, že zistená metabolická odchýlka je spoľahlivá. V niektorých prípadoch sú biochemické ukazovatele v tzv. Šedej zóne, čo ďalej komplikuje diagnózu. Tu môže pomôcť DNA diagnostika. Prítomnosť mutácie ukazuje priemernú predispozíciu počas celého života, aby sa tento biochemický parameter posunul na patologickú stránku. Na rozdiel od biochemického fenotypu, genotyp nepodlieha individuálnym a populačným variáciám charakteristickým pre biochemické parametre. DNA diagnostika teda umožňuje potvrdiť biochemickú diagnózu nezávislou metódou, ako aj vylúčiť prítomnosť iných príčin tejto biochemickej poruchy. Je zrejmé, že maximálna informatívnosť DNA diagnostiky dedičných metabolických porúch sa dosahuje, keď sa kombinuje s klasickými biochemickými metódami.

Pri diskusii o špecifickosti a citlivosti metód diagnostiky DNA je potrebné najprv určiť, o čo ide - určenie špecifickej mutácie alebo hľadanie neznámej genetickej poruchy u pacienta. V prípade špecifickej mutácie, pre ktorú boli vyvinuté spoľahlivé metódy detekcie, je citlivosť a špecifickosť detekcie blízka 100%. Na stanovenie diagnostickej hodnoty celkového molekulárno-genetického testu je potrebné zohľadniť citlivosť detekcie mutácií v kombinácii s ich penetráciou.

Pozitívna diagnostická hodnota testu je do značnej miery určená penetráciou mutácií. Napríklad, detekcia trizómie na chromozóme 21 alebo mutácií špecifických pre Duchennovu svalovú dystrofiu alebo Huntingtonovu chorobu naznačuje, že títo jedinci s pravdepodobnosťou blízkou 100% majú alebo budú ďalej rozvíjať zodpovedajúci klinický syndróm. Takáto vysoká pozitívna diagnostická hodnota však nie je typická pre všetky genetické testy. Pri mutáciách s nízkou penetranciou, napríklad u nosičov hemochromatóznych mutácií, pravdepodobnosť vzniku klinických prejavov nepresiahne niekoľko percent. V takýchto prípadoch detekcia defektu indikuje len predispozíciu k rozvoju tohto ochorenia, ktoré silne závisí od prítomnosti ďalších dedičných faktorov a faktorov prostredia.

Čím jednoduchšia a študovanejšia je genetická štruktúra tohto ochorenia, tým ľahšie je detekovať mutáciu a tým vyššia je citlivosť testu. Prevažná väčšina genetických ochorení je, žiaľ, spôsobená širokou škálou mutácií, ktoré sa často nachádzajú v rôznych génoch. V kombinácii s obmedzenými schopnosťami moderných molekulárnych metód to znižuje citlivosť molekulárno-genetického testovania. Napríklad v súčasnosti, dokonca aj v najlepších molekulárno-genetických laboratóriách pracujúcich s pacientmi s familiárnou hypercholesterolémiou, môžu byť mutácie detegované len u polovice pacientov s overenou klinickou diagnózou. Ďalším príkladom je Duchenne myodystrofia. V tomto prípade môže byť delečná choroba v géne dystrofínu detegovaná len v 70% prípadov a zvyšok pacientov potrebuje ďalšiu histologickú analýzu svalovej biopsie. V prípadoch, keď test nie je schopný zistiť všetky genetické zmeny, ktoré vedú k ochoreniu, jeho negatívna prediktívna sila je nízka.

V určitých situáciách môže byť negatívna prediktívna sila testov DNA veľmi vysoká. Hovoríme o prenatálnej a presymptomatickej diagnostike v prípadoch, keď sú známe patogénne mutácie prítomné u rodičov. V takejto situácii vysoká presnosť molekulárnych metód umožňuje s dostatočnou spoľahlivosťou preukázať nielen prítomnosť, ale aj absenciu rodičovských mutácií u plodu alebo dieťaťa.

V súhrne môžeme povedať, že väčšina molekulárno-genetických testov má významnú pozitívnu prediktívnu silu, čo umožňuje ich použitie na klinike, najmä v prípade vysokej penetrácie a patogenity mutácií. Naproti tomu negatívna prediktívna sila väčšiny molekulárnych testov je malá, okrem prípadov, keď je známe, ktoré mutácie boli u rodičov.

4.5.3. PRÍKLADY POUŽITIA DNA DIAGNOSTIKY V CLINIC

Ako je dobre známe, klasická medicínska genetika opisuje monogénne vysoko penetrantné a klinicky závažné ochorenia. Frekvencia takýchto ochorení zvyčajne nepresahuje 1 na 5000 obyvateľov. Pomocou analýzy DNA možno zistiť približne tisíc monogénnych dedičných ochorení. Zoznam testov a laboratórií, ktoré ich vykonávajú, sa neustále aktualizuje na internete (http://www.geneclinics.org). Väčšina DNA diagnostiky sa teraz používa v genetickom poradenstve a prenatálnej diagnostike, aby sa zabránilo narodeniu detí s patológiou.

Okrem klasických monogénnych prípadov sa však na klinike často vyskytujú dedičné ochorenia, ktoré sú charakterizované relatívne nízkou penetranciou a relatívne miernym priebehom. Tradične boli pripisované monogénnym, avšak nahromadené údaje nedávno ukazujú viac oligogénnej povahy týchto ochorení.

Nasleduje podrobná diskusia o niekoľkých bežných ľudských oligogénnych ochoreniach, ako je hemochromatóza, hereditárna trombofília, familiárna hypercholesterolémia, cystická fibróza a hypertrofická kardiomyopatia. Heterozygotné nosiče mutácií vedúcich k týmto ochoreniam sa vyskytujú v populácii s frekvenciou 1 až 500 až 1 z 20 osôb. V dôsledku vysokej frekvencie populácie v tejto skupine je významný

celkový prínos k ľudskej patológii, pravdepodobne prevyšujúci prínos zriedkavých dedičných chorôb. Pre všetky tieto ochorenia umožňuje testovanie DNA presymptomatickú diagnózu, hemochromatózu, trombofiliu a hypercholesterolémiu a následnú profylaxiu, a to tak farmakologicky, ako aj zmenou životného štýlu.

Je to jedna z najčastejších genetických metabolických porúch, ktoré sa nazývajú vrodené metabolické chyby Hemochromatóza (GC) sa vyskytuje u 1 z 200 - 300 ľudí v severnej Európe.

Klasická triáda - diabetes, cirhóza a pigmentácia kože ("bronzový diabetes") - bola opísaná už v roku 1865 av roku 1935 sa potvrdila rodinná povaha tohto ochorenia. Základom klinických prejavov GC je biochemický defekt - nadmerné hromadenie železa v parenchymálnych bunkách pečene, pankreasu, srdca a prednej hypofýzy. Aby sa zabránilo vzniku klinických prejavov, môžete použiť veľmi jednoduchý a zároveň účinný spôsob - preventívnu flebotómiu. Medziľahlý fenotyp GC je zvýšená hladina železa v plazme a pečeni, ktorá sa hodnotí rôznymi biochemickými testami, ako je saturácia transferínu železom, koncentrácia feritínu a obsah železa v pečeni.

Klinické prejavy GC sú veľmi rôznorodé. Jedným z najčastejších prejavov je chronické poškodenie pečeňových parenchýmov. Charakteristickým znakom je všeobecné alebo lokálne zlepšenie pigmentácie kože. 30-60% pacientov s pokročilým ochorením má diabetes. V počiatočných štádiách GC sa prejavujú nešpecifické symptómy ako letargia, hepatomegália, artropatia, kardiomyopatia, diabetes, hyperpigmentácia kože alebo hypogonadizmus. Klinické prejavy závisia od genetických a vonkajších faktorov, ako je obsah železa v potrave, darovanie krvi a fyziologická strata krvi u žien počas menštruácie.

V roku 1996 bol identifikovaný gén, ktorý bol zodpovedný za najbežnejšiu formu GC, ktorá sa nazýva HFE. Tento gén kóduje transmembránový proteín pozostávajúci z krátkej cytoplazmatickej domény, transmembránovej oblasti a troch extracelulárnych domén, ktoré interagujú s p₂-mikroglobulínu na povrchu bunky. Proteín HFE sa viaže na povrchu enterocytu na receptor transferínu a znižuje afinitu k transferínu, ktorý nesie

železo. V neprítomnosti funkčne aktívneho HFE sa zvyšuje väzba a následná endocytóza transferínu, čo vedie k akumulácii železa v bunke, kde sa skladuje ako komplex s feritínom. U pacientov s keltským pôvodom s klinicky vážnou GC je približne 90% homozygotných pre Cis mutáciu₂₈₂-Pneumatika v géne HFE a väčšina ostatných má kombináciu Cys₂₈₂-Tyr a iná mutácia - GiS_os-Asp. V dôsledku mutácie Cis₂₈₂-Tyr narúša tvorbu disulfidovej väzby v jednej z extracelulárnych domén proteínu HFE, jeho konformácia je narušená a proteín zostáva po syntéze v endoplazmatickom retikule. V dôsledku toho proteín prestáva byť exprimovaný na povrchu bunky, čo vedie k zvýšenému zachyteniu železa, ktoré je nedostatočné pre potreby organizmu. Vo väčšine populácií Caucasoid je frekvencia heterozygotných nosičov alely Cis₂₈₂-Rozsah je asi 10%, a pre Baskov a írskych ľudí keltského pôvodu, frekvencia tohto polymorfizmu môže dosiahnuť 30%. Na rozdiel od Európanov, táto mutácia sa takmer nikdy nenašla v Mongoloids a Negroids. Predpokladá sa mutácia Cis₂₈₂-Pneumatika vznikla asi pred 2000 rokmi v keltskej populácii a rozšírila sa po celej Európe v dôsledku migrácie obyvateľstva, to znamená, že príčinou vysokej frekvencie tejto mutácie je zakladateľský efekt.

Existujú aj iné ochorenia s klinickým obrazom podobným klasickej rodine GC (klasifikovanej aj ako typ 1 GC), ale s iným pôvodom. Juvenilná GC (typ 2), rovnako ako typ 1 GC, je dedená autozomálne recesívnym spôsobom a je spôsobená mutáciami v neznámom géne. GC typu 3 je tiež recesívna choroba a je spojená s mutáciou receptora transferínu. GC 4. a 5. typu sú dedičné dominantne a sú spôsobené mutáciami v génoch ferroportínu, transportujú železo v čreve, respektíve feritín. Všetky tieto formy sú veľmi zriedkavé a dnes ich definícia nehrá praktickú úlohu.

Pneumatika v géne HFE je charakterizovaná vysokou penetranciou vzhľadom na intermediárny fenotyp, to znamená biochemický znak nadbytku železa v tele. 95% mužov vo veku nad 40 rokov, ktorí sú homozygotní pre túto mutáciu, má nadbytok železa a existujú klinické príznaky a symptómy. Premenopauzálne ženy majú nižšie riziko v dôsledku straty krvi počas liečby

menštruácie. Fenotypový účinok mutácie GiS_os-Asp je menej výrazný. Fibróza alebo cirhóza pečene sa deteguje analýzou biopsie u 4-25% homozygotných nosičov alely Cis₂₈₂

Rozsah snímania Okrem toho alela Cis₂₈₂-Tir predisponuje k rozvoju hepatocelulárneho karcinómu. U mužov s GC a cirhózou je relatívne riziko vzniku hepatocelulárneho karcinómu 200-krát vyššie.

SKÚŠANIE MÉDIÍ

Prítomnosť vyššie uvedených príznakov je indikáciou pre genetické testovanie na GC. Diagnóza sa však uskutočňuje počas rozšíreného klinického obrazu, keď je príliš neskoro na vykonanie prevencie primárneho defektu. V tomto ohľade mnohí výskumníci obhajujú potrebu skríningu populácie na prítomnosť GC. Toto ochorenie spĺňa mnohé požiadavky na ochorenia, ktoré sa podrobujú skríningu, t.j. vyskytuje sa pomerne často, má latentnú fázu, ktorá predchádza klinickým prejavom, je ľahko diagnostikovaná biochemickými a genetickými metódami a je možné ju predísť pomocou účinnej a lacnej liečby.

V súčasnosti sa však masový skríning považuje za predčasný kvôli nejasnostiam, ktoré sa týkajú najmä penetrácie GC. Určite sa odporúča testovať príbuzných pacientov s GC, ktorí by mali merať úroveň saturácie transferínu železom, obsah feritínu a biochemické markery hepatálnej dysfunkcie, ako aj zistiť prítomnosť mutácií v géne HFE v polohách 282 a 63.

Z technického hľadiska nie je detekcia týchto mutácií zložitá. Bežne sa používa restrikčná analýza alebo rôzne formy alelicky špecifickej amplifikácie alebo hybridizácie.

4.5.3.2. Dedičná trombofília

Trombofília má tendenciu vyvíjať trombózu spojenú s vrodenými a získanými poruchami zrážania krvi a fibrinolýzou. Trombofília sa najčastejšie prejavuje vo forme venóznej trombózy a tromboembolizmu, ktoré sa vyskytujú s frekvenciou približne 1 na 1000 obyvateľov ročne.

Existujú familiárne formy trombofílie, opísané už v 50. rokoch. Prvé zistené príčiny dedičnej trombofílie (NTF) boli nedostatok antitrombínu III,

proteín C a jeho proteínový kofaktor S. Neskôr boli identifikované ďalšie dve formy NTF - mutácia koagulácie faktora V, ktorá spôsobuje rezistenciu faktora V na aktivovaný proteín C a mutáciu v prothrombínovom géne G20210A, čo zvyšuje hladinu protrombínu v plazme. Mierna hyperhomocysteinémia, často spojená s rozšíreným polymorfizmom v géne MTHFR, je tiež rizikovým faktorom pre venóznu trombózu.

THROMBOEMBOLICKÁ KOMPLIKÁCIA Závažnosť klinických prejavov NTF sa veľmi líši. Často postupujú vo veľmi miernej forme a ich prítomnosť môže byť určená len laboratórnymi metódami. V mnohých prípadoch sa však u nosičov mutácií vyvinie hlboká žilová trombóza dolných končatín, pľúcny tromboembolizmus, povrchová tromboflebitída, ako aj venózne trombózy inej lokalizácie. Tieto dedičné defekty zvyčajne nie sú spojené s rizikom arteriálnej oklúzie. NTF predisponujú k rozvoju trombózy v mladom veku: až 40% pacientov mladších ako 45 rokov s nevyprovokovanou hlbokou žilovou trombózou má jednu z foriem NTF. U starších pacientov alebo v prítomnosti provokujúcich faktorov NTF pozorovaných v 30% prípadov trombózy. U pacientov s kombináciou dedičných defektov sa riziko tromboembolických komplikácií ďalej zvyšuje.

Dedičný nedostatok antitrombínu III a proteínov C a S sa vyskytuje celkovo menej ako 1% populácie, ale u pacientov s venóznym tromboembolizmom (VTE) sa nachádza v takmer 10% prípadov. Riziko VTE u takýchto pacientov je 5-8-krát vyššie ako vo všeobecnej populácii. Dôvodom nedostatku týchto prirodzených antikoagulancií môže byť zníženie ich syntézy alebo (častejšie) zníženie funkčnej aktivity proteínu pri zachovaní normálnej hladiny. Defekty syntézy alebo fungovania proteínov sú spôsobené stovkami rôznych mutácií v týchto génoch.

Dedičná rezistencia na aktivovaný proteín C je najčastejšou príčinou NTF. Vo viac ako 95% prípadov je rezistencia spôsobená mutáciou missense v géne faktora V, nazývanom Leyden, v ktorom v polohe 506 je arginín nahradený glutamínom. Tento aminokyselinový zvyšok normálne spôsobuje proteolytické štiepenie faktora V aktivovaným proteínom C. Proteín C je prírodný antikoagulant, ktorý je aktivovaný trombín-trombomodulínom.

komplex na endotelových bunkách a ničí faktory Va viii, vedú k zastaveniu tvorby trombov. Tento proces sa významne urýchľuje v prítomnosti proteínu S, ktorý pôsobí ako proteínový kofaktor C. Ak existuje aminokyselinová substitúcia v faktore Va Arg₅₀₆-Gin aktivovaný proteín C ho nemôže rozbiť, čo vedie k zachovaniu aktivity faktora Vа a k zvýšeniu tvorby trombov (Obr. 4.17).

Leidenská mutácia sa vyskytuje takmer výlučne medzi belochmi, v ktorých približne 5% populácie tvoria nositelia. Vzhľadom na vysokú frekvenciu tejto genetickej formy vo všeobecnej populácii by sa to však malo označovať ako polymorfizmus

Obr. 4.17. Rezistencia na aktivovaný proteín C, spôsobená Leidenovou mutáciou.

v literatúre sa na ňu fixoval názov mutácie. U pacientov s VTE je frekvencia tejto mutácie vyššia a je okolo 20%. Riziko VTE u nosičov Leidenovej mutácie závisí od dávky génu: v heterozygotoch sa zvyšuje 2-7-krát av homozygotoch 40-80-krát. Celková pravdepodobnosť vzniku tromboembolizmu počas života nosičov tejto mutácie je 30%.

Polymorfná alela G20210A v 3'-netranslatovanej oblasti génu protrombínu vo všeobecnej populácii sa vyskytuje s frekvenciou 2%, ale u pacientov s VTE sa podiel nosičov polymorfizmu zvyšuje na 7%. Prítomnosť polymorfizmu G20210A v protrombínovom géne teda zvyšuje riziko VTE asi 3-krát. Patologickým účinkom tohto polymorfizmu je zvýšenie aktivity protrombínu v plazme. Hladina protrombínu v AA homozygotoch je 1,5 krát vyššia ako hladina homozygotov v normálnej GG alele, ktorá prispieva k trombóze. Zdá sa, že mutácia G → A označuje typ mutácií so získaním funkcie, pretože zvyšuje účinnosť spracovania 3'-konca mRNA, čo vedie k akumulácii mRNA a zvýšeniu syntézy proteinu protrombínu.

Ďalším predispozičným faktorom trombózy je zvýšená hladina homocysteínu, aminokyseliny vytvorenej počas metabolizmu metionínu. Mierny nárast homocysteínu zvyšuje riziko arteriálnej a venóznej trombózy. Dôvodom zvýšenia môže byť buď abnormálna diéta (nedostatok pyridoxínu, kobalamínu, folátu) alebo genetické faktory, ako napríklad polymorfizmus Al.₆₇₇

Hriadeľ v géne metyléntetrahydrofolát reduktázy, enzým, ktorý hrá dôležitú úlohu pri určovaní hladín homocysteínu v plazme. Aktivita tohto variantu enzýmu je len asi 1/3 normálu. Približne 10% belochov je heterozygotným nosičom tohto polymorfizmu. Frekvencia VTE v izolovaných nosičoch tohto polymorfizmu sa nelíši od normálu, ale rad údajov ukazuje, že polymorfizmus C677T prispieva k manifestácii iných NTF.

BEREMENALITA A PSTETRICKÁ PATOLÓGIA Počas tehotenstva sa zvyšuje hladina koagulačných faktorov závislých od vitamínu K, znižuje sa obsah proteínu S a inhibuje sa fibrinolýza. Tieto zmeny sú fyziologicky uskutočniteľné, pretože sú zamerané na zníženie krvných strát počas pôrodu, ale tiež zvyšujú pravdepodobnosť VTE počas tehotenstva (2,5-krát) a najmä v období po pôrode (20-krát).

V prítomnosti NTF je táto pravdepodobnosť ešte vyššia a môže dosiahnuť 100-násobok u homozygotov pre Leidenovu mutáciu faktora V. Väčšina (až 60%) žien s VTE, ktoré sa vyvinuli počas tehotenstva, má Leidenskú mutáciu.

Okrem venózneho tromboembolizmu prispievajú NTF k rozvoju pôrodníckej patológie. Porušenie kompletnej placentárnej cirkulácie maternice v dôsledku trombózy môže viesť k rôznym komplikáciám v tehotenstve, ako je potrat, mŕtvopohlavie, poruche placenty, preeklampsia a intrauterinná retardácia rastu. Početné štúdie preukázali zvýšený výskyt NTF u pacientov s týmito komplikáciami. Existujú tiež dôkazy, že prítomnosť mutácie nielen u matky, ale aj u plodu môže ďalej zvyšovať riziko trombózy a infarktu placenty, čo vedie k strate plodu. Relatívne riziko komplikácií gravidity u heterozygotných nosičov Leidenovej mutácie alebo polymorfizmu protrombínového génu G20210A podľa rôznych štúdií sa zvýšilo v priemere o 2-3 krát.

Prijatie perorálnych kontraceptív tiež prispieva k rozvoju VTE. Tento účinok sa zvyšuje u žien s NTF. Riziko vzniku VTE u nosičov Leidenovej mutácie s perorálnymi kontraceptívami sa podľa rôznych odhadov zvyšuje o 20-65-krát. V prítomnosti protrombínu G20210A je riziko VTE mierne nižšie, ale tiež významne prevyšuje normálnu hodnotu. Na základe týchto pozorovaní sa neodporúča používať perorálne kontraceptíva pre ženy s nedostatkom prirodzených antikoagulancií, homozygotmi pre Leydenovu mutáciu av prítomnosti kombinovaných defektov.

Hormonálna substitučná liečba po menopauze je ďalší iatrogénny stav s 2-4-násobným zvýšením rizika VTE. V prítomnosti Leidenovej mutácie sa relatívne riziko môže zvýšiť o 15-krát a frekvencia opakovanej trombózy sa tiež zvyšuje. V tomto ohľade sa odporúča, aby nositelia NTF, ktorí mali epizódy VTE, nemali používať hormonálnu substitučnú liečbu.

INDIKÁCIE PRE GENETICKÚ ANALÝZU Analýza Leidenovej mutácie a polymorfizmu protrombínu G20210A, ako aj stanovenie deficitu antitrombínu a proteínov C a S je účinnou metódou na identifikáciu jedincov so zvýšeným rizikom trombotických stavov. Detekcia týchto mutácií umožňuje nositeľom vykonávať profylaktickú antikoagulačnú liečbu.

Vzhľadom na nízku absolútnu frekvenciu VTE nie je hromadný skríning populácie na prítomnosť NTF opodstatnený. Za prítomnosť NTF sa považuje za vhodnejšie preskúmať tieto skupiny pacientov: t

• osoby s VTE bez ohľadu na vek a závažnosť prejavov;

• ženy s jedným alebo viacerými spontánnymi potratmi v neskorom štádiu alebo s dvoma alebo viacerými potratmi;

• tehotné ženy s intrauterinnou retardáciou rastu alebo s prerušením placenty;

• príbuzní prvého stupňa príbuznosti pacienta s NTF v histórii;

• ženy s rodinnou anamnézou NTF pred použitím perorálnej antikoncepcie, hormonálnej substitučnej liečby alebo tehotenstva.

DIAGNOSTICKÉ TESTY Testy s vysokou prioritou na prítomnosť NTF zahŕňajú:

• stanovenie aktivity antitrombínu (amidolytická metóda);

• stanovenie aktivity proteínu C (koagulometrická alebo amidolytická metóda);

• stanovenie koncentrácie proteínu S (celkové a voľné frakcie antigénu);

• koagulometrické stanovenie rezistencie voči aktivovanému proteínu C;

• stanovenie Leidenovej mutácie faktora V;

• stanovenie polymorfizmu protrombínu G20210A;

• stanovenie hladín homocysteínu v plazme.

Ako je zrejmé z vyššie uvedeného zoznamu, deficiencia antitrombínu a proteínov C a S sa stanoví funkčnými metódami. Je to spôsobené tým, že tieto chyby sú spôsobené veľkým počtom mutácií a ich identifikácia vyžaduje veľké úsilie a náklady, pričom funkčné analýzy sú jednoduché a spoľahlivé.

Analýza Leidenovej mutácie a polymorfizmu protrombínu je jednoduchá a dobre dopĺňa funkčné testy. Zdá sa, že analýza polymorfizmu C677T v géne metylén tetragidovej rofolatreduktázy nemá samostatnú diagnostickú hodnotu a mala by byť použitá v kombinácii s biochemickým stanovením koncentrácie homocysteínu v plazme. Použitie tejto sady testov umožňuje detegovať dedičné defekty koagulačných faktorov alebo zvýšenie homocysteínu u približne 40% pacientov s VTE.

Najspoľahlivejšou metódou na identifikáciu Leidenovej mutácie a protrombínu G20210A je reštrikčná analýza, ale široko sa používa aj alelovo špecifická PCR a hybridizácia.

4.5.3.3. Familiárna hypercholesterolémia

Familiárna hypercholesterolémia (FHC) je zjavne najbežnejším autozomálne dominantným ľudským ochorením. Frekvencia FHD vo väčšine populácií je 1 v 500. V populáciách so zakladajúcim efektom sú heterozygotné formy oveľa bežnejšie: 1 zo 70 v Afrikánoch v Južnej Afrike a 1 z 200 v Kanaďanoch francúzskeho pôvodu. Z rovnakého dôvodu sa zvyšuje frekvencia FHD vo Fínsku, Druze a Libanone.

Nie všetky prípady FHC sú klinicky diagnostikované. Napríklad v Rusku uviedlo menej ako 1% pacientov s FHCS klinickú diagnózu a najúčinnejšia diagnóza (viac ako 40% identifikovaných nosičov) sa vykonáva na Islande kvôli malej veľkosti populácie s výrazným zakladateľským efektom a malou variabilitou mutability.

Hlavnými diagnostickými funkciami SGHS sú zvýšený cholesterol v krvi, prítomnosť xantómov šľachy u pacienta alebo príbuzných prvého stupňa a dominantný model dedičnosti zvýšeného cholesterolu alebo ischemickej choroby srdca.

Klinicky sa SGHS prejavuje zvýšeným rizikom aterosklerózy a jej komplikácií. Mechanizmy spájajúce zvýšenie cholesterolu s rozvojom ischemickej choroby srdca nie sú úplne známe. Predpokladá sa, že vysoká hladina LDL bohatého na cholesterol prispieva k ich prenikaniu do steny cievy, kde oxiduje a spúšťa reťazec bunkových reakcií vedúcich k akumulácii lipidov a lokálnej reorganizácii cievnej steny, čo vedie k aterosklerotickému plaku. V prípade FHC sa riziko úmrtia na infarkt myokardu v mladom veku - do 40 rokov - zvyšuje 100-násobne. U neliečených mužov s FHD vo veku 60 rokov je pravdepodobnosť CHD približne 75%. Podľa niektorých odhadov len polovica mužov s SGHS žije do 60 rokov. Priemerný vek nástupu ICHS je u mužov 40-45 rokov au žien 10 rokov. Choroba koronárnych artérií u pacientov s FHD sa teda vyvíja o 10 - 20 rokov skôr ako priemer populácie.

Statíny a iné lieky znižujúce lipidy sa účinne používajú na zníženie plazmatických hladín lipoproteínov u SHHS.

Najťažší pacienti (spravidla ide o homozygotné prípady) sa liečia odstránením nadbytku LDL výmenou plazmy. Niekedy sa používa transplantácia pečene.

BIOCHEMICKÉ A GENETICKÉ MECHANIZMY

Keď je SGHS cholesterol zvýšený v dôsledku zvýšenia plazmatického LDL. Táto metabolická porucha je spojená so znížením klírensu LDL v pečeni v dôsledku zníženia expresie alebo aktivity bunkových receptorov sprostredkujúcich príjem LDL častíc (LDL receptory). Aktivita LDL receptora vo FHCS klesá na všetkých bunkách exprimujúcich tento receptor, avšak funkčné následky sú spojené hlavne s poruchou receptora v pečeni, pretože porušenie konverzie cholesterolu na žlčové kyseliny vedie k zníženiu jeho vylučovania cez črevá. Podobné biochemické abnormality sú pozorované s mutačnou zmenou proteínu apoB-100, čo je ligand pre LDL receptor. V dôsledku tejto mutácie už LDL receptory nerozpoznajú LDL častice a akumulujú sa v plazme.

LDL receptorový gén obsahuje 18 exónov, ktoré kódujú šesť funkčných domén tohto proteínu: signálny peptid, ligand viažucu doménu, doménu homológnu s predchodcom epidermálneho rastového faktora, O-glykozylačné miesto, transmembránové a cytoplazmatické domény. Všetky známe mutácie v géne LDLR sa zhromažďujú v databáze UMD-LDLR, ktorá je prístupná cez internet. Počet vstupov v nej presiahol 800 a naďalej rastie. Podľa databázy UMD-LDLR predstavujú jednonukleotidové substitúcie 90% všetkých mutácií v géne LDLR, väčšina z nich sú mutácie chýbajúce a nezmyselné. Zvyšných 10% sú hlavne makrotransformácie spôsobené nerovnomernou rekombináciou s viac ako 30 kópiami Alu sekvencií prítomných v tomto géne. V promótore bolo nájdených menej ako 10 mutácií.

Hoci SGHS je monogénne ochorenie, fenotypová expresia, a to závažnosť ICHS, sa značne líši aj medzi pacientmi, ktorí nesú rovnaké mutácie. Niektorí pacienti žijú do veku 80 rokov a viac, zatiaľ čo iní zomierajú na srdcový infarkt po 20 rokoch. Faktory ovplyvňujúce klinické prejavy môžu byť vonkajšie, metabolické a genetické.

Z environmentálnych faktorov zohrávajú osobitnú úlohu fajčenie a stravovacie návyky. Fajčenie je jedným z najsilnejších prediktorov úmrtnosti na ischemickú chorobu srdca u pacientov s FHD. Úloha stravy vo vývoji

FHCS sa preukázalo porovnaním pacientov čínskeho pôvodu žijúcich v Kanade s nositeľmi rovnakých mutácií, ale žijúcich v Číne.

Kanadský Číňania majú LDL cholesterol o 70% vyšší ako v Číne. Okrem toho 6 zo 16 heterozygotov žijúcich v Kanade malo xantómy a 4 CHD. Žiadny z 18 opýtaných žijúcich v Číne nemal xantóm alebo ischemickú chorobu srdca. Zdá sa, že takéto rozdiely v klinických prejavoch sú spojené s rôznou konzumáciou nenasýtených tukov. Tento príklad živo ilustruje modifikujúci účinok vonkajších faktorov, ako je diéta, na fenotyp heterozygotných SHKS.

Priebeh ochorenia silne závisí od typu mutácie spôsobujúcej hyperlipidémiu. Najzávažnejšia hypercholesterolémia sa vyvíja v prítomnosti nulových mutácií, čo vedie k úplnej absencii aktívneho receptora, zatiaľ čo mutácie so zachovaním parciálnej syntézy alebo aktivity LDL receptora zvyčajne spôsobujú miernejšie ochorenie.

Existuje množstvo biochemických parametrov, ktoré modifikujú vývoj ischemickej choroby srdca u pacientov s SHHS. Tieto metabolické faktory sú: HDL cholesterol, C-reaktívny proteín a fibrinogén. Niektoré z týchto faktorov, ako je HDL-cholesterol a lipoproteín Lp (a), majú výrazný genetický základ. Medzi ďalšie dokázané alebo podozrivé genetické faktory patria mutácie v lipoproteínovom lipázovom géne - izoformy apolipoproteínu E, primérové varianty esteru cholesterolu, polymorfizmus paraoxonázy (polymorfizmus enzýmu lipidového peroxidu), konkrétny genotyp metyléntetrahydrofolát reduktázy (spojený so zvýšenou hladinou homocysteínu). ako aj mikrozomálny triglycerid nesúci proteín, ktorý ovplyvňuje vylučovanie VLDL.

Geneticky sú mutácie LDL receptora hlavným faktorom určujúcim vývoj FHC. Príspevok iných génov je nepopierateľný, avšak kvôli relatívne malému počtu pacientov s identifikovanými mutáciami LDL receptora sú potrebné ďalšie štúdie modifikujúcich génov. V ideálnom prípade stanovenie genotypu pacienta týmito ďalšími génmi umožní určiť stupeň rizika ochorenia koronárnych artérií a iných komplikácií u nosičov konkrétnej mutácie v LDL receptore alebo géne apoB-100.

Individuálna hladina cholesterolu podlieha prirodzeným zmenám, takže nie je možné vyvodiť žiadny záver na základe jedného merania cholesterolu

o dostupnosti SGHS. Okrem toho hladina cholesterolu závisí od veku, pohlavia a líši sa v rôznych populáciách. Hladina cholesterolu vo FHCS často presahuje priemernú hladinu vo všeobecnej populácii, preto nie je možné stanoviť diagnózu len na základe výsledkov merania cholesterolu v plazme v niektorých prípadoch.

V súčasnosti je detekcia mutácií v LDL receptore alebo géne apoB-100 bežným kritériom pri diagnostike FHC. Mutácia na 3500. nukleotide v géne apoB-100 (rodinný defekt apoB) je najčastejšou príčinou FHC vo väčšine populácií. V Európe a krajinách, kde žijú ľudia z Európy (Austrália, USA, Kanada a Nový Zéland), je táto mutácia spôsobená u 3-5% pacientov s FHCS. V krajinách s komplexnou genetickou štruktúrou ochorenia sa mutácie vyskytujú u 30-50% pacientov s klinickou diagnózou SGHS. Je to spôsobené nedostatočnou citlivosťou skríningových metód a nesprávnou diagnózou stanovenou na základe hladiny cholesterolu a klinických prejavov. Existuje tiež možnosť existencie ďalších génov, okrem LDLR a APOB, mutácií, v ktorých sú sprevádzané podobným klinickým obrazom.

V mnohých populáciách je DNA diagnostika SGHS významne zjednodušená v dôsledku prítomnosti obmedzeného počtu mutantných alel.

Vo väčšine geneticky otvorených populácií, ku ktorým patrí Rusko, sa však v géne receptora LDL nenachádza žiadna jediná mutácia častejšie ako u 1% pacientov s FHC a zvyčajne oveľa menej často. V tomto ohľade hrajú hlavnú úlohu pri diagnostike DNA FHCS skríningové metódy na vyhľadávanie mutácií, ako je stanovenie polymorfizmu konformácie jednovláknovej DNA, po ktorom nasleduje potvrdenie sekvenovaním.

4.5.3.4. Cystická fibróza

Cystická fibróza (CF) je jednou z najbežnejších a súčasne závažných autozomálne recesívnych ochorení u ľudí. Medzi Európanmi je nosná frekvencia

1 až 50 a klinické formy sa vyskytujú v závislosti od regiónu s frekvenciou 1 až 2 až 3 000 osôb.

CF dostal svoje meno z povahy mikroskopických zmien pozorovaných v pankrease u takýchto pacientov. Choroba postihuje aj pľúca, pečeň, tenké črevo a mužský reprodukčný systém. Kľúčovú úlohu v patogenéze hrá nadmerná sekrécia hlienu epitelom týchto orgánov, čo vedie k obštrukcii priedušiek alebo vylučovacích kanálov pečene a pankreasu. Napriek výraznému zlepšeniu symptomatickej liečby pacienti s CF zvyčajne nežijú dlhšie ako 20-30 rokov. Hlavnou príčinou smrti je poškodenie pľúc spôsobené blokádou priedušiek, čo vytvára priaznivé prostredie pre sekundárne infekcie. Chronické infekcie a zápalová reakcia vedú k fibróze pľúcneho tkaniva, ktorá v kombinácii s obštrukciou dýchacieho traktu môže spôsobiť zlyhanie dýchania. U 65% pacientov zabraňuje blokovanie kanálikov pankreasu vylučovaniu tráviacich enzýmov do čreva, čo vedie k poruchám trávenia. Podobne aj porušenie sekrécie žlče pečeňou, pozorované u 5% pacientov. Okrem týchto prejavov sa u 10% novorodencov vyvinie obštrukcia tenkého čreva, ktorá si vyžaduje chirurgický zákrok. Okrem toho 95% mužov s CF má neplodnosť. Charakteristickým znakom CF, ktorý sa široko používa na jeho diagnostiku, je zvýšená slanosť potu spojená so zhoršenou reabsorpciou C1.

epitelu obloženia kanálov potných žliaz.

KF je spôsobená mutáciami v proteíne kódovanom génom CFTR (regulátor transmembránovej vodivosti cystickej fibrózy). Tento gén sa skladá z 27 exónov a kóduje proteín s molekulovou hmotnosťou 168 kDa, ktorý obsahuje dve transmembránové domény, dve intracelulárne domény viažuce nukleotid a regulačnú doménu. Tento proteín je kanálom pre C1-ióny. Tento kanál je aktivovaný cAMP-dependentnou proteínkinázou, ktorá fosforyluje regulačnú doménu. Exit C1 - z bunky začína reťazec reakcií, ktoré vedú k uzavretiu Na + kanálov a podporujú produkciu sekrécie slizníc.

Najčastejšou príčinou CF je delécia troch nukleotidov v 508. kodóne, čo vedie k strate fenylalanínu. Frekvencia tejto mutácie u pacientov s CF sa pohybuje od 50% v strednej Európe do takmer 90% na severe. Výsledkom tejto mutácie je narušenie normálneho spracovania proteínu a po syntéze nie je transportované do plazmatickej membrány, ale je zadržané v endoplazmatickom retikule a degradované. Existuje však veľké množstvo

iné mutácie poškodzujúce tento proteín; ich počet sa blíži 1000. Tieto zriedkavejšie mutácie môžu mať odlišný účinok na chloridový kanál, napríklad čiastočne alebo úplne znížiť syntézu proteínov, narušiť jeho intracelulárny transport alebo znížiť funkčnú aktivitu kanála. Niektoré z týchto mutácií spôsobujú iba čiastočné zníženie syntézy alebo aktivity kanála, čo môže viesť k rôznym funkčným prejavom. V prípadoch, keď je zachovaných menej ako 3% aktivity, sa vyvíja ťažká CF, sprevádzaná léziou pankreasu. Ak ušetríte 3-8% aktivity, ovplyvňuje pľúca a pankreas je normálny. Ak je aktivita kanála C1 8-12%, pozorujú sa mierne formy, ako napríklad azoospermia u mužov. Takýto jednoduchý vzťah však nie je vždy dodržaný. Predpovedanie priebehu ochorenia je možné len vtedy, ak existuje homozygotnosť na deléciu fenylalanínu-508 alebo súčasnú prítomnosť tejto delécie a mutácie G551D. V prítomnosti týchto mutácií prebieha choroba v klasickej ťažkej forme s léziou pankreasu. Vo väčšine ostatných prípadov je ťažké odhadnúť vzťah medzi typom mutácie a prejavom ochorenia. Stále rastie dôkaz, že CF je oligogénne ochorenie a jeho fenotypové prejavy závisia nielen od povahy mutácie, ale aj od súboru modifikujúcich génov prítomných v pacientovi.

CF sa môže takmer vždy diagnostikovať v prenatálnom štádiu s použitím analýzy DNA z choriových klkov, buď priamo určením mutácií, alebo použitím analýzy väzieb s použitím polymorfných intragénnych markerov v prípadoch, keď nie sú známe mutácie u chorého dieťaťa. V súčasnosti sa zvažuje otázka skríningu populácie na prítomnosť CF. Akumulované informácie o genetickej štruktúre CF nám umožnili vybrať 30 mutácií z takmer 1000 známych, čo však vysvetľuje 90% prípadov CF v rôznych regiónoch Európy a USA. Technicky je DNA diagnostika CF veľmi dobre vyvinutá a na jej realizáciu sa vyrába množstvo komerčných súprav.

4.5.3.5. Hypertrofická kardiomyopatia

Hypertrofická kardiomyopatia (HCM) je jednou z najbežnejších ľudských chorôb s výraznou genetickou predispozíciou. Vyskytuje sa s frekvenciou 1 z 500, čo je významne vyššia ako frekvencia inej rodinnej formy kardiomyopatie - dilatovanej (1 z 2500). HCM je dedičné

na autozomálne dominantný typ a je charakterizovaný penetranciou až do 75%. Klinicky sa ochorenie prejavuje formou hypertrofie ľavej a / alebo pravej komory a zvýšením predsieňovej veľkosti. Hypertrofia je zvyčajne asymetrická a ovplyvňuje interventrikulárne septum. Histologicky sa v srdcovom svale pozoruje hypertrofia a nepravidelné usporiadanie kardiomyocytov, ako aj intersticiálna fibróza. Toto ochorenie vedie k arytmiám a náhlej smrti, ako aj srdcovému zlyhaniu.

Príčinou ochorenia na molekulárnej úrovni je dysfunkcia proteínov, ktoré tvoria sarkomér, takže hcmp sa niekedy nazýva sarkomérna choroba. Hypertrofia je kompenzačná odpoveď myokardu na pokles kontraktility. V súčasnosti bolo identifikovaných 11 génov, mutácií, ktoré vedú k hcmp (tabuľka 4.11).

Mutácie sarkomérnych proteínov majú odlišný vplyv na kontraktilnú funkciu kardiomyocytov. Výsledkom je, že missense mutácie často tvoria stabilné, ale neaktívne proteíny, ktoré sú vložené do sarkómu a narušujú jeho funkciu, t.j. majú dominantný negatívny účinok. Na rozdiel od mutácií

Tabuľka 4.11. Mutácie vedúce k hypertrofickej kardiomyopatii

s posunom v ráme vedú k tvorbe neaktívnych skrátených proteínov, ktoré podliehajú zrýchlenej degradácii. V oboch prípadoch klesá kontraktilná aktivita a vyvíja sa kompenzačná hypertrofická reakcia.

Typ mutácie môže ovplyvniť závažnosť ochorenia. Napríklad vysoké riziko náhlej srdcovej smrti je spojené s mutáciami v géne MYH7 Arg_{4 oz.}-Gin, Arg_45z-Cis a arg_72z-Gly. Na rozdiel od mutácie Gly_25b-Glu, Val₆₀₆-Met a Lei₉₀₈- Hriadeľ nie je spojený so zvýšeným rizikom arytmií. Mutácie v géne MYBPC3 sú zvyčajne spojené s miernou hypertrofiou u mladých pacientov, neskorým nástupom ochorenia a relatívne priaznivou prognózou. Preto znalosť typu mutácie nielen potvrdzuje diagnózu hcmp, ale v niektorých prípadoch pomáha pri určovaní prognózy.

Vzhľadom na významnú genetickú heterogenitu predstavuje molekulárna diagnostika hcmp určitú zložitosť. Kvôli rôznorodosti mutácií sa na vyhľadávanie tohto ochorenia používajú hlavne skríningové metódy, ako je analýza polymorfizmu konformácie jednovláknovej DNA, elektroforéza v denaturačnom gradiente a denaturačná HPLC. Hľadanie mutácií sa vykonáva hlavne v géne ťažkého reťazca β-myozínu, ako aj v génoch srdcového troponínu T a proteínu C viažuceho myozín.

Biochemická diagnostika ochorení pečene. Stručná informácia o štruktúre pečene.

Biochemická diagnostika chorôb

Dekódovanie biochemickej analýzy krvi

Čo ukazuje biochemický krvný test?

Aké sú indikácie biochemickej analýzy krvi?

Ako urobiť krvný test pre biochémiu?

Normy biochemickej analýzy krvi (tabuľka)

Ako rozlúštiť biochemickú analýzu?

Celkový proteín

bilirubín

enzýmy

Kyselina močová

Koľko je biochemický krvný test?

Biochémia a patobiochémia pečene. Biochemická diagnostika ochorenia pečene

Biochemická diagnostika chorôb

KAPITOLA 4 BIOCHEMICKÁ DIAGNOSTIKA PATOLOGICKÝCH PROCESOV A HEREDITÁRNYCH CHORÔB t

Prečítajte Si O Čistení Pečeň

Populárne Kategórie

Cysta Pečene

Rakoviny Pečene